Raman-analyse av spytt som biomarkør for KOLS (CORSAI)

Hovedmålet med prosjektet er å skape og validere en ny metode basert på Raman spektroskopi (RS) analyse av spytt for optimalisert og personlig behandling av pasienter med kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS). Kombinasjonen av de kliniske instrumentelle dataene med RS-tilnærmingen vil øke kvaliteten på den kliniske praksisen gjennom hensiktsmessig stratifisering av pasienter, det vil si tidlig identifisering av KOLS-fenotyper, påfølgende tilordning av presise terapier, vurdering av potensiell eksaserbasjonsrisiko og overholdelse av terapi. Ved å integrere instrumentelle og RS-tiltak med kunstig intelligens (AI), vil pasientenes KOLS-fenotype bli forutsagt, noe som gjør det mulig å effektivt styre ressursene til helsevesenet. Gjennomførbarheten av arbeidet bekreftes av bruken av en sensitiv, rask og miniatyrisert RS, brukt av ikke-spesialisert personell og for å lage et omsorgspunkt (POC) på en tilgjengelig biovæske. Den tverrfaglige tilnærmingen innen prekliniske, kliniske og store datahåndteringsfelt oppnås gjennom samarbeid mellom akademi, klinisk forskning og industri.

Med utgangspunkt i det udekkede kliniske behovet, vil CORSAI bygge en nær kobling mellom biomedisinsk forskning, klinisk forskning, datavitenskap mot integrering av PM i klinisk praksis og på etiske, juridiske og sosiale implikasjoner på tvers av deltakerlandene og utover. Hovedmålet er innsamling av RS-signaler fra spyttet til KOLS-pasienter, karakterisert for alvorlighetsstadier og fenotyper ved bruk av GERA-instrumenter, og tilsvarende CTRL- og astmapasienter (AsP). Opprettelsen og korrelasjonen av datasettet vil føre til oppnåelse av spesifikke mål: I) Identifikasjon av den spesifikke KOLS, CTRL og AsP RF; II) Overvåking av terapioverholdelse gjennom medikamentsignalet i spytt; III) Definisjon av KOLS-fenotyper på basis av RF korrelert med instrumentelle GERA-data; IV) Overvåking av rehabiliteringsprosedyrer og effekter; V) Assosiasjon av høy eksaserbasjonsrisiko for spesifikke KOLS-pasienter; VI) Oppretting av en klassifiseringsmodell fra RS-databasen; VII) Anvendelse av høyytelses databehandling for dataanalyse; VIII) Integrasjon av den bærbare RS som POC. Nyheten til CORSAI er avhengig av den avanserte metodikken, brakt til sengen takket være bærbare instrumenter. Den minimalt invasive prosedyren som brukes for spyttinnsamlingen og hastigheten for Raman-ervervelsen representerer relevante fordeler som tillater kontinuerlig overvåking av pasienters etterlevelse av terapi, og moderne diskriminering av KOLS-fenotyper med høy forverringshastighet. Gjennomførbarheten av prosjektet er direkte relatert til den biologiske prøven og foreslått teknologi, allerede testet i kliniske omgivelser19: i) enkel innsamling og lagring av spytt passer til det kliniske scenariet; ii) minimal prøvepreparering og bærbar enhet muliggjør POC-bruk av ikke-spesialisert personell, med AI fjernbeslutningsveiledning.

PRØVEINNSAMLING: Spyttinnsamling fra alle de utvalgte forsøkspersonene vil bli utført etter Salivette (SARSTEDT)-produsentens instruksjoner. For å begrense variasjonen i spyttinnhold som ikke er relatert til KOLS, vil spytt bli hentet fra alle forsøkspersoner til et fast tidspunkt, etter en passende etterslep fra mating og tannpuss. Pre-analytiske parametere (dvs. lagringstemperatur og tid mellom innsamling og behandling), vil kostholds- og røykevaner bli registrert på riktig måte. Kort fortalt vil vattpinnen fjernes, legges i munnen og tygges i 60 sekunder for å stimulere spyttutskillelsen. Deretter vil vattpinnen sentrifugeres i 2 minutter ved 1000 g for å fjerne cellefragmenter og matrester. Innsamlede prøver vil bli lagret ved -80°C.

PRØVEBEHANDLING: For Raman-analysen vil en dråpe av hver prøve støpes på en aluminiumsfolie for å oppnå Surface Enhanced Raman-spredning (SERS).

DATAINNSAMLING: SERS-spektra vil bli innhentet ved hjelp av et Aramis Raman-mikroskop (Horiba Jobin-Yvon, Frankrike) utstyrt med en laserlyskilde som opererer ved 785 nm med lasereffekt fra 25-100 % (maks. effekt 512 mW). Innhentingstid mellom 10-30 sekunder vil bli brukt. Instrumentet vil bli kalibrert før hver analyse ved å bruke referansebåndet av silisium ved 520,7 cm-1. Raman-spektra vil bli samlet fra 35 punkter etter et linjekart fra kanten til midten av dråpen. Spectra vil bli anskaffet i regionen mellom 400 og 1600 cm-1 ved bruk av et 50x objektiv (Olympus, Japan). Spektraoppløsningen er omtrent 1,2 cm-1. Programvarepakken LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Frankrike) skal brukes til kartdesign og innhenting av spektre.

DATABEHANDLING: Alle de innhentede spektrene vil tilpasses med en fjerdegrads polynomisk grunnlinje og normaliseres av enhetsvektor ved å bruke den dedikerte programvaren LabSpec 6. Bidraget til substratet vil bli fjernet fra hvert spektre. Den statistiske analysen for å validere metoden vil bli utført ved hjelp av en multivariat analysetilnærming. Principal Component Analysis (PCA) vil bli utført for å redusere datadimensjoner og bevise store trender. De første 20 resulterende hovedkomponentene (PC-er) vil bli brukt i en klassifiseringsmodell, Linear Discriminant Analysis (LDA), for å diskriminere dataene og maksimere variansen mellom de valgte gruppene. Det minste antallet PC-er vil bli valgt for å forhindre overtilpassing av data. Leave-one-out kryssvalidering og forvirringsmatrisetest vil bli brukt for å evaluere metodesensitiviteten, presisjonen og nøyaktigheten til LDA-modellen. Mann-Whitney vil bli utført på PC-score for å verifisere forskjellene statistisk relevante mellom de analyserte gruppene. Korrelasjon og partiell korrelasjonsanalyse vil bli utført ved bruk av Spearmans test, forutsatt som gyldig korrelasjon kun koeffisientene med en p-verdi lavere enn 0,05. Den statistiske analysen vil bli utført ved bruk av Origin2018 (OriginLab, USA).

DYP LÆRING: Datasettene vil bli analysert og behandlet ved hjelp av Deep Learning-modeller med sikte på å oppdage betydelige mønstre som kan brukes til å bekrefte og analysere trender og for å utvikle spådommer og beslutningsstøtte om KOLS-stratifiseringen. Teknikker for dataforsterkning og automatisk hyperparameteroptimalisering vil bli utviklet for å forbedre klassifiseringsytelsen og forbedre generaliseringsevnen. For å oppnå en avveining mellom prediktiv nøyaktighet og tolkbarhet, vil en klasseaktiveringskartlegging (CAM)-basert tilnærming bli brukt for å visualisere de aktive variablene i spektrene for å identifisere diskriminerende mønster for å trekke ut de mest informative spektrale funksjonene.

UNIMIB og GERA vil implementere en forklaringsmekanisme for å identifisere de aktive variablene i hele spekteret og tolke de interne funksjonsrepresentasjonene og datatransformasjonsrørledningen til CNN-modellen. UNIMIB og GERA vil integrere de ulike beregningsmodulene i en modulær beregningspipeline for pasientmessig klassifisering.