Raman-analyse af spyt som biomarkør for KOL (CORSAI)

Hovedmålet med projektet er at skabe og validere en ny metode baseret på Raman-spektroskopi (RS)-analyse af spyt til optimeret og personlig håndtering af patienter med kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL). Kombinationen af ​​de kliniske instrumentelle data med RS-metoden vil øge kvaliteten af ​​den kliniske praksis gennem passende stratificering af patienter, dvs. tidlig identifikation af KOL-fænotyper, deraf følgende tilskrivning af præcise terapier, vurdering af potentiel eksacerbationsrisiko og overholdelse af terapi. Ved at integrere instrumentelle og RS-foranstaltninger med kunstig intelligens (AI), vil patienters KOL-fænotype blive forudsagt, hvilket giver mulighed for effektivt at styre ressourcerne i sundhedssystemet. Gennemførligheden af ​​arbejdet bekræftes af brugen af ​​en følsom, hurtig og miniaturiseret RS, der bruges af ikke-specialiseret personale og til oprettelse af et plejepunkt (POC) på en tilgængelig biovæske. Den multidisciplinære tilgang inden for prækliniske, kliniske og big data management områder opnås gennem samarbejde mellem akademi, klinisk forskning og industri.

Med udgangspunkt i det udækkede kliniske behov vil CORSAI bygge en tæt forbindelse mellem biomedicinsk forskning, klinisk forskning, datavidenskab hen imod integration af PM i klinisk praksis og om etiske, juridiske og sociale implikationer på tværs af de deltagende lande og videre. Hovedformålet er indsamling af RS-signaler fra spyt fra KOL-patienter, karakteriseret for sværhedsgradsstadier og fænotyper ved hjælp af GERA-instrumenter og tilsvarende CTRL- og astmapatienter (AsP). Oprettelse og korrelation af datasættet vil føre til opnåelse af specifikke mål: I) Identifikation af den specifikke KOL, CTRL og AsP RF; II) Overvågning af terapiadhærens gennem lægemiddelsignalet i spyt; III) Definition af KOL-fænotyper på basis af RF korreleret med instrumentelle GERA-data; IV) Overvågning af rehabiliteringsprocedurer og -effekter; V) Sammenhæng med en høj eksacerbationsrisiko for specifikke KOL-patienter; VI) Oprettelse af en klassifikationsmodel fra RS-databasen; VII) Anvendelse af højtydende databehandling til dataanalyse; VIII) Integration af den bærbare RS som POC. Det nye ved CORSAI er afhængig af den avancerede metodik, der er bragt til sengen takket være bærbare instrumenter. Den minimalt invasive procedure, der anvendes til spytopsamlingen, og hastigheden for Raman-opsamlingen repræsenterer relevante fordele, der muliggør kontinuerlig overvågning af patienters overholdelse af terapi og den nutidige diskrimination af KOL-fænotyper med høj forværringshastighed. Gennemførligheden af ​​projektet er direkte relateret til den biologiske prøve og den foreslåede teknologi, som allerede er testet i kliniske omgivelser19: i) nem indsamling og opbevaring af spyt passer til det kliniske scenarie; ii) minimal prøveforberedelse og bærbar enhed muliggør POC-brug af ikke-specialiseret personale med AI fjernbeslutningsvejledning.

PRØVEINDSAMLING: Spytopsamling fra alle de udvalgte forsøgspersoner vil blive udført efter Salivette (SARSTEDT) producentens instruktioner. For at begrænse variabiliteten i spytindhold, der ikke er relateret til KOL, vil spyt blive indhentet fra alle forsøgspersoner på et fast tidspunkt, efter en passende forsinkelsestid fra fodring og tandbørstning. Præanalytiske parametre (dvs. opbevaringstemperatur og tid mellem indsamling og behandling), vil kost- og rygevaner blive korrekt registreret. Kort fortalt vil podepinden blive fjernet, lagt i munden og tygget i 60 sekunder for at stimulere spytudskillelsen. Derefter vil podepinden blive centrifugeret i 2 minutter ved 1.000 g for at fjerne cellefragmenter og madrester. Indsamlede prøver vil blive opbevaret ved -80°C.

PRØVEBEHANDLING: Til Raman-analysen vil en dråbe af hver prøve blive støbt på en aluminiumsfolie for at opnå Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).

DATAINDSAMLING: SERS-spektre vil blive erhvervet ved hjælp af et Aramis Raman-mikroskop (Horiba Jobin-Yvon, Frankrig) udstyret med en laserlyskilde, der opererer ved 785 nm med lasereffekt, der spænder fra 25-100 % (maks. effekt 512 mW). Optagelsestid mellem 10-30 sekunder vil blive brugt. Instrumentet vil blive kalibreret før hver analyse ved hjælp af referencebåndet for silicium ved 520,7 cm-1. Raman-spektre vil blive indsamlet fra 35 punkter efter et linjekort fra kanten til midten af ​​dråben. Spectra vil blive erhvervet i området mellem 400 og 1600 cm-1 ved hjælp af et 50x objektiv (Olympus, Japan). Spektra opløsning er omkring 1,2 cm-1. Softwarepakken LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Frankrig) vil blive brugt til kortdesign og erhvervelse af spektre.

DATABEHANDLING: Alle de erhvervede spektre vil blive tilpasset med en fjerdegrads polynomiel basislinje og normaliseret af enhedsvektor ved hjælp af den dedikerede software LabSpec 6. Substratets bidrag vil blive fjernet fra hvert spektre. Den statistiske analyse for at validere metoden vil blive udført ved hjælp af en multivariat analysetilgang. Principal Component Analysis (PCA) vil blive udført for at reducere datadimensioner og bevise store tendenser. De første 20 resulterende Principal Components (PC'er) vil blive brugt i en klassifikationsmodel, Linear Discriminant Analysis (LDA), for at skelne dataene, hvilket maksimerer variansen mellem de udvalgte grupper. Det mindste antal pc'er vil blive valgt for at forhindre dataovertilpasning. Leave-one-out krydsvalidering og konfusionsmatrixtest vil blive brugt til at evaluere metodefølsomheden, præcisionen og nøjagtigheden af ​​LDA-modellen. Mann-Whitney vil blive udført på pcs score for at verificere forskellene statistisk relevante mellem de analyserede grupper. Korrelations- og partiel korrelationsanalyse vil blive udført ved hjælp af Spearman's test, idet der kun antages som gyldig korrelation koefficienter med en p-værdi lavere end 0,05. Den statistiske analyse vil blive udført ved hjælp af Origin2018 (OriginLab, USA).

DEEP Learning: Datasættene vil blive analyseret og behandlet ved hjælp af Deep Learning-modeller med det formål at opdage væsentlige mønstre, der kan bruges til at bekræfte og analysere tendenser og til at udvikle forudsigelser og beslutningsstøtte om KOL-stratificeringen. Teknikker til dataforøgelse og automatisk hyperparameteroptimering vil blive udviklet for at forbedre klassificeringsydelser og forbedre generaliseringsevnen. For at nå en afvejning mellem forudsigelig nøjagtighed og fortolkbarhed, vil en klasseaktiveringskortlægning (CAM)-baseret tilgang blive anvendt til at visualisere de aktive variable i spektrene for at identificere diskriminerende mønster for at udtrække de mest informative spektrale træk.

UNIMIB og GERA vil implementere en forklaringsmekanisme til at identificere de aktive variable i hele spektret og fortolke de interne egenskabsrepræsentationer og datatransformationspipeline i CNN-modellen. UNIMIB og GERA vil integrere de forskellige beregningsmoduler i en modulær beregningspipeline til patientmæssig klassificering.