Análisis Raman de la saliva como biomarcador de la EPOC (CORSAI)

El objetivo principal del proyecto es crear y validar un nuevo método basado en el análisis de saliva por espectroscopia Raman (RS) para el manejo optimizado y personalizado de pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La combinación de los datos instrumentales clínicos con el enfoque RS aumentará la calidad de la práctica clínica a través de la estratificación adecuada de los pacientes, es decir, la identificación temprana de los fenotipos de la EPOC, la consiguiente atribución de terapias precisas, la evaluación del riesgo potencial de exacerbación y la adherencia a la terapia. Mediante la integración de medidas instrumentales y de RS con Inteligencia Artificial (IA), se predecirá el fenotipo de EPOC de los pacientes, lo que permitirá dirigir eficientemente los recursos del sistema de salud. La viabilidad del trabajo se corrobora con el uso de un RS sensible, rápido y miniaturizado, utilizado por personal no especializado y para la creación de un punto de atención (POC) sobre un biofluido accesible. El enfoque multidisciplinario en los campos preclínicos, clínicos y de gestión de big data se logra a través de la colaboración de la academia, la investigación clínica y la industria.

A partir de la necesidad clínica insatisfecha, CORSAI creará un vínculo estrecho entre la investigación biomédica, la investigación clínica y la ciencia de datos hacia la integración de PM en la práctica clínica y las implicaciones éticas, legales y sociales en los países participantes y más allá. El objetivo principal es la recogida de señales RS de la saliva de pacientes con EPOC, caracterizadas por estadios de gravedad y fenotipos mediante instrumentos GERA, y los correspondientes CTRL y pacientes con asma (AsP). La creación y correlación del conjunto de datos conducirá a la consecución de objetivos específicos: I) Identificación de la EPOC, CTRL y AsP RF específicos; II) Monitoreo de la adherencia a la terapia a través de la señal del fármaco en saliva; III) Definición de fenotipos de EPOC sobre la base de la RF correlacionada con datos instrumentales de GERA; IV) Seguimiento de los procedimientos y efectos de la rehabilitación; V) Asociación de alto riesgo de exacerbaciones a pacientes específicos con EPOC; VI) Creación de un modelo de clasificación a partir de la base de datos RS; VII) Aplicación de la informática de alto rendimiento para el análisis de datos; VIII) Integración del RS portátil como POC. La novedad de CORSAI radica en la metodología avanzada, traída al lado de la cama gracias a instrumentos portátiles. El procedimiento mínimamente invasivo utilizado para la recolección de saliva y la velocidad para la adquisición de Raman representan ventajas relevantes que permiten el monitoreo continuo de la adherencia de los pacientes a la terapia y la discriminación contemporánea de fenotipos de EPOC con alta tasa de exacerbación. La viabilidad del proyecto está directamente relacionada con la muestra biológica y la tecnología propuesta, ya probada en el entorno clínico19: i) la fácil recolección y almacenamiento de saliva se adapta al escenario clínico; ii) la preparación mínima de muestras y el dispositivo portátil permiten el uso de POC por parte de personal no especializado, con guía de decisiones remotas de IA.

RECOGIDA DE MUESTRAS: La recogida de saliva de todos los sujetos seleccionados se realizará siguiendo las instrucciones del fabricante de Salivette (SARSTEDT). Para limitar la variabilidad en el contenido salival no relacionado con la EPOC, se obtendrá saliva de todos los sujetos a una hora fija, después de un tiempo de espera apropiado desde la alimentación y el cepillado de dientes. Parámetros preanalíticos (es decir, la temperatura de almacenamiento y el tiempo entre la recolección y el procesamiento), se registrará adecuadamente el hábito dietético y de tabaquismo. Brevemente, se retirará el hisopo, se colocará en la boca y se masticará durante 60 segundos para estimular la salivación. Luego se centrifugará el hisopo durante 2 minutos a 1.000 g para eliminar fragmentos de células y restos de comida. Las muestras recolectadas se almacenarán a -80° C.

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: Para el análisis Raman, una gota de cada muestra se vaciará sobre una lámina de aluminio para lograr la Dispersión Raman Mejorada en la Superficie (SERS).

RECOPILACIÓN DE DATOS: Los espectros SERS se adquirirán utilizando un microscopio Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, Francia) equipado con una fuente de luz láser que opera a 785 nm con una potencia láser que oscila entre el 25 y el 100 % (potencia máxima de 512 mW). Se utilizará un tiempo de adquisición entre 10 y 30 segundos. El instrumento será calibrado antes de cada análisis utilizando la banda de referencia de silicio a 520,7 cm-1. Los espectros Raman se recopilarán de 35 puntos siguiendo un mapa de líneas desde el borde hasta el centro de la gota. Los espectros se adquirirán en la región entre 400 y 1600 cm-1 utilizando un objetivo de 50x (Olympus, Japón). La resolución de los espectros es de aproximadamente 1,2 cm-1. El paquete de software LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Francia) se utilizará para el diseño de mapas y la adquisición de espectros.

PROCESAMIENTO DE DATOS: Todos los espectros adquiridos se ajustarán con una línea base polinomial de cuarto grado y se normalizarán por vector unitario utilizando el software dedicado LabSpec 6. La contribución del sustrato se eliminará de cada espectro. El análisis estadístico para validar el método se realizará utilizando un enfoque de análisis multivariante. Se realizará un análisis de componentes principales (PCA) para reducir las dimensiones de los datos y evidenciar las principales tendencias. Los primeros 20 Componentes Principales (PC) resultantes se utilizarán en un modelo de clasificación, Análisis Discriminante Lineal (LDA), para discriminar los datos maximizando la varianza entre los grupos seleccionados. Se seleccionará el menor número de PC para evitar el sobreajuste de datos. Se utilizará la validación cruzada de exclusión y la prueba de matriz de confusión para evaluar la sensibilidad, la precisión y la exactitud del método del modelo LDA. Mann-Whitney se realizará en puntajes de PC para verificar las diferencias estadísticamente relevantes entre los grupos analizados. El análisis de correlación y correlación parcial se realizará mediante la prueba de Spearman, asumiendo como correlación válida únicamente los coeficientes con un valor de p inferior a 0,05. El análisis estadístico se realizará utilizando Origin2018 (OriginLab, EE. UU.).

APRENDIZAJE PROFUNDO: los conjuntos de datos se analizarán y procesarán utilizando modelos de Aprendizaje Profundo con el objetivo de descubrir patrones significativos que puedan usarse para confirmar y analizar tendencias y para desarrollar predicciones y apoyo a la toma de decisiones sobre la estratificación de la EPOC. Se desarrollarán técnicas de aumento de datos y optimización automática de hiperparámetros para mejorar el rendimiento de la clasificación y mejorar la capacidad de generalización. Con el fin de llegar a un compromiso entre la precisión predictiva y la interpretabilidad, se aplicará un enfoque basado en el mapeo de activación de clases (CAM) para visualizar las variables activas en los espectros con el fin de identificar patrones discriminatorios para extraer las características espectrales más informativas.

UNIMIB y GERA implementarán un mecanismo de explicación para identificar las variables activas en todo el espectro e interpretar las representaciones de características internas y la canalización de transformación de datos del modelo CNN. UNIMIB y GERA integrarán los diversos módulos computacionales en una canalización computacional modular para la clasificación por pacientes.