Analiza ramanowska śliny jako biomarkera POChP (CORSAI)

Głównym celem projektu jest stworzenie i walidacja nowej metody opartej na analizie śliny metodą spektroskopii ramanowskiej (RS) dla zoptymalizowanego i spersonalizowanego postępowania z pacjentami z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (POChP). Połączenie instrumentalnych danych klinicznych z podejściem RS podniesie jakość praktyki klinicznej poprzez odpowiednią stratyfikację chorych, tj. wczesną identyfikację fenotypów POChP, konsekwentne przypisanie precyzyjnych terapii, ocenę potencjalnego ryzyka zaostrzeń i przestrzeganie zaleceń terapeutycznych. Dzięki integracji pomiarów instrumentalnych i RS ze sztuczną inteligencją (AI) możliwe będzie przewidywanie fenotypu POChP pacjentów, co pozwoli na efektywne kierowanie zasobami systemu ochrony zdrowia. Wykonalność pracy potwierdza zastosowanie czułego, szybkiego i zminiaturyzowanego RS, używanego przez niewyspecjalizowany personel i do stworzenia punktu opieki (POC) na dostępnym biopłynie. Multidyscyplinarne podejście w dziedzinach przedklinicznych, klinicznych i zarządzania dużymi danymi jest osiągane dzięki współpracy akademii, badań klinicznych i przemysłu.

Wychodząc od niezaspokojonej potrzeby klinicznej, CORSAI zbuduje ścisłe powiązanie między badaniami biomedycznymi, badaniami klinicznymi, nauką o danych w celu włączenia PM do praktyki klinicznej oraz implikacji etycznych, prawnych i społecznych w uczestniczących krajach i poza nimi. Głównym celem jest zebranie sygnałów RS ze śliny pacjentów z POChP, scharakteryzowanych pod kątem stopni ciężkości i fenotypów za pomocą instrumentów GERA oraz odpowiednich pacjentów z CTRL i astmą (AsP). Stworzenie i korelacja zbioru danych doprowadzi do realizacji określonych celów: I) Identyfikacja specyficznej POChP, CTRL i AsP RF; II) Monitorowanie przestrzegania terapii poprzez sygnał leku w ślinie; III) Definicja fenotypów POChP na podstawie RF skorelowanej z danymi instrumentalnymi GERA; IV) Monitorowanie procedur i efektów rehabilitacji; V) Związek wysokiego ryzyka zaostrzenia z określonymi pacjentami z POChP; VI) Stworzenie modelu klasyfikacyjnego z bazy danych RS; VII) Zastosowanie obliczeń wielkiej skali do analizy danych; VIII) Integracja przenośnego RS jako POC. Nowość CORSAI polega na zaawansowanej metodologii, przeniesionej do łóżka dzięki przenośnym instrumentom. Minimalnie inwazyjna procedura pobierania śliny oraz szybkość akwizycji Ramana to istotne zalety pozwalające na ciągłe monitorowanie przestrzegania zaleceń terapeutycznych przez pacjentów oraz współczesną dyskryminację fenotypów POChP o wysokim wskaźniku zaostrzeń. Wykonalność projektu jest bezpośrednio związana z próbką biologiczną i proponowaną technologią, przetestowaną już w warunkach klinicznych19: i) łatwe pobieranie i przechowywanie śliny pasuje do scenariusza klinicznego; ii) minimalne przygotowanie próbki i przenośne urządzenie umożliwiają korzystanie z POC przez niewyspecjalizowany personel, ze zdalnym wspomaganiem decyzji przez sztuczną inteligencję.

POBIERANIE PRÓBEK: Pobieranie śliny od wszystkich wybranych osób zostanie przeprowadzone zgodnie z instrukcjami producenta Salivette (SARSTEDT). Aby ograniczyć zmienność zawartości śliny niezwiązaną z POChP, ślina będzie pobierana od wszystkich osób w ustalonym czasie, po odpowiednim czasie od karmienia i szczotkowania zębów. Parametry przedanalityczne (tj. temperatura przechowywania i czas między pobraniem a przetwarzaniem), nawyki żywieniowe i palenie będą odpowiednio rejestrowane. Krótko mówiąc, wymaz zostanie usunięty, umieszczony w jamie ustnej i żuty przez 60 sekund w celu pobudzenia wydzielania śliny. Następnie wymaz będzie wirowany przez 2 minuty przy 1000 g w celu usunięcia fragmentów komórek i resztek jedzenia. Pobrane próbki będą przechowywane w temperaturze -80°C.

PRZETWARZANIE PRÓBEK: Do analizy ramanowskiej kropla każdej próbki zostanie wylana na folię aluminiową w celu uzyskania powierzchniowego wzmocnionego rozpraszania ramanowskiego (SERS).

ZBIERANIE DANYCH: Widma SERS będą pozyskiwane przy użyciu mikroskopu Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, Francja) wyposażonego w laserowe źródło światła pracujące przy długości fali 785 nm i mocy lasera w zakresie 25-100% (moc maksymalna 512 mW). Zastosowany zostanie czas akwizycji od 10 do 30 sekund. Przyrząd będzie kalibrowany przed każdą analizą przy użyciu pasma odniesienia krzemu przy 520,7 cm-1. Widma ramanowskie będą zbierane z 35 punktów zgodnie z mapą liniową od krawędzi do środka kropli. Widma będą pozyskiwane w obszarze między 400 a 1600 cm-1 przy użyciu obiektywu 50x (Olympus, Japonia). Rozdzielczość widm wynosi około 1,2 cm-1. Pakiet oprogramowania LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Francja) zostanie wykorzystany do projektowania map i akwizycji widm.

PRZETWARZANIE DANYCH: Wszystkie uzyskane widma zostaną dopasowane do linii bazowej wielomianu czwartego stopnia i znormalizowane za pomocą wektora jednostkowego przy użyciu dedykowanego oprogramowania LabSpec 6. Wkład substratu zostanie usunięty z każdego widma. Analiza statystyczna w celu walidacji metody zostanie przeprowadzona przy użyciu podejścia opartego na analizie wielowymiarowej. Analiza głównych składowych (PCA) zostanie przeprowadzona w celu zmniejszenia wymiarów danych i wykazania głównych trendów. Pierwsze 20 wynikowych składowych głównych (PC) zostanie wykorzystanych w modelu klasyfikacyjnym, liniowej analizie dyskryminacyjnej (LDA), w celu rozróżnienia danych maksymalizującego wariancję między wybranymi grupami. Zostanie wybrana najmniejsza liczba komputerów, aby zapobiec nadmiernemu dopasowaniu danych. Do oceny czułości metody, precyzji i dokładności modelu LDA zostanie wykorzystany test walidacji krzyżowej i matrycy pomyłek. Mann-Whitney zostanie przeprowadzony na wynikach PC w celu zweryfikowania statystycznie istotnych różnic między analizowanymi grupami. Analiza korelacji i korelacji cząstkowych zostanie przeprowadzona za pomocą testu Spearmana, przyjmując za ważną korelację tylko współczynniki o wartości p mniejszej niż 0,05. Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu oprogramowania Origin2018 (OriginLab, USA).

GŁĘBOKIE UCZENIE: Zbiory danych będą analizowane i przetwarzane przy użyciu modeli głębokiego uczenia się w celu odkrycia znaczących wzorców, które można wykorzystać do potwierdzenia i analizy trendów oraz do opracowania prognoz i wsparcia decyzji dotyczących stratyfikacji POChP. Opracowane zostaną techniki powiększania danych i automatycznej optymalizacji hiperparametrów w celu zwiększenia wydajności klasyfikacji i poprawy zdolności do generalizacji. Aby osiągnąć kompromis między predykcyjną dokładnością a interpretowalnością, zastosowane zostanie podejście oparte na mapowaniu aktywacji klas (CAM) do wizualizacji aktywnych zmiennych w widmach w celu zidentyfikowania wzoru dyskryminacyjnego w celu wydobycia najbardziej pouczających cech widmowych.

UNIMIB i GERA wdrożą mechanizm wyjaśniania, aby zidentyfikować aktywne zmienne w całym widmie i zinterpretować wewnętrzne reprezentacje cech i potok transformacji danych modelu CNN. UNIMIB i GERA zintegrują różne moduły obliczeniowe w modułowym potoku obliczeniowym w celu klasyfikacji pod kątem pacjenta.