A nyál mint a COPD biomarkere Raman-analízise (CORSAI)

A projekt fő célja egy új, a nyál Raman-spektroszkópiás (RS) elemzésén alapuló módszer létrehozása és validálása a krónikus obstruktív tüdőbetegségben (COPD) szenvedő betegek optimalizált és személyre szabott kezelésére. A klinikai műszeres adatok kombinálása az RS-megközelítéssel javítja a klinikai gyakorlat minőségét a betegek megfelelő rétegzésével, azaz a COPD fenotípusok korai azonosításával, a precíz terápiák következetes hozzárendelésével, a lehetséges exacerbáció kockázatának felmérésével és a terápia betartásával. A műszeres és RS intézkedések mesterséges intelligenciával (AI) való integrálásával a betegek COPD-fenotípusa előrejelzésre kerül, ami lehetővé teszi az egészségügyi rendszer erőforrásainak hatékony irányítását. A munka megvalósíthatóságát támasztja alá egy érzékeny, gyors és miniatürizált RS használata, amelyet nem szakosodott személyzet használ, és egy hozzáférhető biofluidon egy gondozási pont (POC) létrehozására szolgál. A multidiszciplináris megközelítés a preklinikai, klinikai és nagy adatkezelési területeken az akadémia, a klinikai kutatás és az ipar együttműködésével valósul meg.

A kielégítetlen klinikai igényből kiindulva a CORSAI szoros kapcsolatot épít ki az orvosbiológiai kutatások, a klinikai kutatások és az adattudományok között a PM klinikai gyakorlatba történő integrálása, valamint az etikai, jogi és társadalmi vonatkozások tekintetében a részt vevő országokban és azon kívül. A fő cél a COPD-s betegek nyálából származó RS-jelek gyűjtése, amelyek súlyossági stádiumaira és fenotípusaira jellemzik GERA műszerekkel, valamint a megfelelő CTRL és asztmás betegek (AsP) segítségével. Az adatkészlet létrehozása és korrelációja specifikus célok megvalósításához vezet: I) A specifikus COPD, CTRL és AsP RF azonosítása; II) A terápia adherenciájának monitorozása a nyálban lévő gyógyszerjelen keresztül; III) A COPD fenotípusok meghatározása az RF alapján, korrelált a műszeres GERA adatokkal; IV) A rehabilitációs eljárások és hatások nyomon követése; V) A magas exacerbációs kockázat összefüggése specifikus COPD-s betegekkel; VI) Osztályozási modell készítése az RS adatbázisból; VII) Nagy teljesítményű számítástechnika alkalmazása adatelemzésre; VIII) A hordozható RS integrálása POC-ként. A CORSAI újdonsága a fejlett módszertanon alapul, amelyet a hordozható műszereknek köszönhetően az ágy oldalára hoztak. A nyálgyűjtéshez alkalmazott minimális invazív eljárás és a Raman felvétel sebessége jelentős előnyökkel jár, amelyek lehetővé teszik a betegek terápiás adherenciájának folyamatos nyomon követését, valamint a COPD fenotípusok kortárs megkülönböztetését a magas exacerbációval. A projekt megvalósíthatósága közvetlenül kapcsolódik a biológiai mintához és a javasolt technológiához, amelyeket már klinikai környezetben teszteltek19: i) a nyál egyszerű összegyűjtése és tárolása megfelel a klinikai forgatókönyvnek; ii) minimális minta-előkészítés és hordozható eszköz lehetővé teszi a POC használatát nem szakosodott személyzet számára, mesterséges intelligencia távoli döntési irányításával.

MINTAGYŰJTÉS: Az összes kiválasztott alany nyálgyűjtése a Salivette (SARSTEDT) gyártójának utasításait követve történik. A COPD-vel nem összefüggő nyáltartalom változékonyságának korlátozása érdekében az összes alanytól meghatározott időpontban, az etetéstől és a fogmosástól számított megfelelő késleltetési idő után nyálát kell gyűjteni. Az elemzés előtti paraméterek (pl. tárolási hőmérséklet, valamint a begyűjtés és a feldolgozás közötti idő), az étkezési és dohányzási szokásokat megfelelően rögzíteni kell. Röviden: a tampont eltávolítják, a szájba helyezik, és 60 másodpercig rágják, hogy serkentse a nyálfolyást. Ezután a tampont 2 percig 1000 g-vel centrifugáljuk, hogy eltávolítsuk a sejtfragmenseket és az ételmaradékot. Az összegyűjtött mintákat -80°C-on tároljuk.

MINTAFELDOLGOZÁS: A Raman-analízishez minden mintából egy cseppet alumíniumfóliára öntünk, hogy elérjük a Surface Enhanced Raman-szórást (SERS).

ADATGYŰJTÉS: A SERS spektrumokat egy Aramis Raman mikroszkóp (Horiba Jobin-Yvon, Franciaország) segítségével veszik fel, amely 785 nm-en működő lézerfényforrással van felszerelve, lézerteljesítménye 25-100% (maximális teljesítmény 512 mW). 10-30 másodperc közötti adatgyűjtési idő kerül felhasználásra. A műszert minden elemzés előtt kalibrálni kell az 520,7 cm-1-es szilícium referenciasáv használatával. A Raman-spektrumokat 35 pontról gyűjtik össze a csepp szélétől a középpontig tartó vonaltérkép alapján. A spektrumokat a 400 és 1600 cm-1 közötti régióban 50-szeres objektívvel (Olympus, Japán) veszik fel. A spektrum felbontása körülbelül 1,2 cm-1. A LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Franciaország) szoftvercsomagot térképtervezéshez és spektrumok felvételéhez használják majd.

ADATFELDOLGOZÁS: Az összes megszerzett spektrumot egy negyedik fokú polinomiális alapvonalra illesztjük, és egységvektorral normalizáljuk a LabSpec 6 dedikált szoftverrel. A szubsztrát hozzájárulását minden egyes spektrumból eltávolítjuk. A módszer validálására szolgáló statisztikai elemzést többváltozós elemzési megközelítéssel kell elvégezni. Az adatdimenziók csökkentése és a főbb tendenciák bizonyítása érdekében főkomponens-elemzést (PCA) végeznek. Az első 20 eredményül kapott főkomponenst (PC) egy osztályozási modellben, a Linear Discriminant Analysisben (LDA) fogják használni az adatok megkülönböztetésére, maximalizálva a kiválasztott csoportok közötti eltérést. A legkevesebb PC-t választják ki az adatok túlillesztésének elkerülése érdekében. Az LDA-modell módszer érzékenységének, pontosságának és pontosságának értékelésére az egyet elhagyó keresztellenőrzést és a zavaros mátrix tesztet használjuk. A Mann-Whitney-t PC-pontszámokon végzik el, hogy igazolják a statisztikailag releváns különbségeket az elemzett csoportok között. A korrelációs és parciális korrelációs analízist Spearman-teszttel végezzük, és csak a 0,05-nél kisebb p-értékű együtthatókat feltételezzük érvényes korrelációnak. A statisztikai elemzés az Origin2018 (OriginLab, USA) segítségével történik.

DEEP LEARNING: Az adatkészleteket Deep Learning modellekkel elemezzük és dolgozzuk fel azzal a céllal, hogy olyan jelentős mintákat fedezzünk fel, amelyek felhasználhatók a trendek megerősítésére és elemzésére, valamint előrejelzések és döntéstámogatás kialakítására a COPD rétegződéssel kapcsolatban. Az osztályozási teljesítmény javítása és az általánosítási képesség javítása érdekében az adatkiegészítés és az automatikus hiperparaméter-optimalizálás technikáit fejlesztik ki. A prediktív pontosság és az értelmezhetőség közötti kompromisszum elérése érdekében osztályaktivációs leképezés (CAM) alapú megközelítést alkalmazunk a spektrumokban lévő aktív változók megjelenítésére, hogy megkülönböztető mintát azonosítsunk a leginkább informatív spektrális jellemzők kinyeréséhez.

Az UNIMIB és a GERA egy magyarázó mechanizmust valósít meg az aktív változók teljes spektrumban történő azonosítására, valamint a CNN modell belső jellemző-reprezentációinak és adattranszformációs folyamatának értelmezésére. Az UNIMIB és a GERA a különböző számítási modulokat egy moduláris számítási folyamatba integrálja a páciensek szerinti osztályozás érdekében.