Análise Raman da Saliva como Biomarcador da DPOC (CORSAI)

O principal objetivo do projeto é criar e validar um novo método baseado na análise da saliva por espectroscopia Raman (RS) para o manejo otimizado e personalizado de pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). A combinação dos dados instrumentais clínicos com a abordagem RS aumentará a qualidade da prática clínica através da estratificação adequada dos pacientes, ou seja, identificação precoce dos fenótipos da DPOC, consequente atribuição de terapias precisas, avaliação do risco potencial de exacerbação e adesão à terapia. Pela integração de medidas instrumentais e RS com Inteligência Artificial (IA), o fenótipo de DPOC dos pacientes será previsto, permitindo direcionar eficientemente os recursos do sistema de saúde. A viabilidade do trabalho é corroborada pela utilização de um RS sensível, rápido e miniaturizado, utilizado por pessoal não especializado e para a criação de um ponto de atendimento (POC) sobre um biofluido acessível. A abordagem multidisciplinar em campos pré-clínicos, clínicos e de gerenciamento de big data é alcançada através da colaboração da academia, pesquisa clínica e indústria.

A partir da necessidade clínica não atendida, a CORSAI construirá um vínculo estreito entre pesquisa biomédica, pesquisa clínica, ciência de dados para a integração do PM na prática clínica e nas implicações éticas, legais e sociais nos países participantes e além. O objetivo principal é a coleta de sinais de RS da saliva de pacientes com DPOC, caracterizados por estágios de gravidade e fenótipos usando instrumentos GERA, e correspondentes CTRL e pacientes com asma (AsP). A criação e correlação do conjunto de dados levará ao cumprimento dos objetivos específicos: I) Identificação do DPOC, CTRL e AsP RF específicos; II) Monitoramento da adesão à terapia através do sinal do medicamento na saliva; III) Definição dos fenótipos da DPOC com base na FR correlacionada com os dados instrumentais do GERA; IV) Acompanhamento dos processos e efeitos da reabilitação; V) Associação de alto risco de exacerbação a pacientes específicos com DPOC; VI) Criação de um modelo de classificação a partir da base de dados do RS; VII) Aplicação de computação de alto desempenho para análise de dados; VIII) Integração do RS portátil como POC. A novidade do CORSAI está na metodologia avançada, trazida à beira do leito graças aos instrumentos portáteis. O procedimento minimamente invasivo utilizado para a coleta da saliva e a velocidade para a aquisição do Raman representam vantagens relevantes que permitem o monitoramento contínuo da adesão dos pacientes à terapia e a discriminação contemporânea dos fenótipos da DPOC com alta taxa de exacerbação. A viabilidade do projeto está diretamente relacionada à amostra biológica e à tecnologia proposta, já testada no cenário clínico19: i)fácil coleta e armazenamento de saliva se adequa ao cenário clínico; ii) preparação mínima de amostras e dispositivo portátil permitem o uso de POC por pessoal não especializado, com orientação de decisão remota por IA.

COLETA DE AMOSTRA: A coleta de saliva de todos os indivíduos selecionados será realizada seguindo as instruções do fabricante do Salivette (SARSTEDT). Para limitar a variabilidade no conteúdo salivar não relacionado à DPOC, a saliva será obtida de todos os indivíduos em um horário fixo, após um intervalo de tempo apropriado entre a alimentação e a escovação dos dentes. Parâmetros pré-analíticos (ou seja, temperatura de armazenamento e tempo entre coleta e processamento), hábitos alimentares e tabágicos serão devidamente registrados. Resumidamente, o swab será retirado, colocado na boca e mastigado por 60 segundos para estimular a salivação. Em seguida, o swab será centrifugado por 2 minutos a 1.000 g para remover fragmentos de células e restos de alimentos. As amostras coletadas serão armazenadas a -80° C.

PROCESSAMENTO DA AMOSTRA: Para a análise Raman, uma gota de cada amostra será moldada em uma folha de alumínio para obter o Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).

COLETA DE DADOS: Os espectros SERS serão adquiridos usando um microscópio Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, França) equipado com uma fonte de luz laser operando a 785 nm com potência de laser variando de 25-100% (potência máxima 512 mW). O tempo de aquisição entre 10-30 segundos será usado. O instrumento será calibrado antes de cada análise usando a banda de referência de silício em 520,7 cm-1. Os espectros Raman serão coletados de 35 pontos seguindo um mapa de linhas da borda ao centro da gota. Os espectros serão adquiridos na região entre 400 e 1600 cm-1 usando uma objetiva de 50x (Olympus, Japão). A resolução do espectro é de cerca de 1,2 cm-1. O pacote de software LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, França) será usado para o desenho do mapa e aquisição dos espectros.

PROCESSAMENTO DE DADOS: Todos os espectros adquiridos serão ajustados com uma linha de base polinomial de quarto grau e normalizados por vetor unitário usando o software dedicado LabSpec 6. A contribuição do substrato será removida de cada espectro. A análise estatística para validar o método será realizada utilizando uma abordagem de análise multivariada. A análise de componentes principais (PCA) será realizada para reduzir as dimensões dos dados e evidenciar as principais tendências. Os primeiros 20 Componentes Principais (CPs) resultantes serão utilizados em um modelo de classificação, Análise Discriminante Linear (LDA), para discriminar os dados maximizando a variância entre os grupos selecionados. O menor número de PCs será selecionado para evitar o superajuste dos dados. A validação cruzada leave-one-out e o teste da matriz de confusão serão utilizados para avaliar a sensibilidade, precisão e exatidão do método do modelo LDA. Os escores de Mann-Whitney serão realizados nos PCs para verificar as diferenças estatisticamente relevantes entre os grupos analisados. A análise de correlação e correlação parcial será realizada por meio do teste de Spearman, assumindo como correlação válida apenas os coeficientes com p-valor inferior a 0,05. A análise estatística será realizada no Origin2018 (OriginLab, EUA).

APRENDIZAGEM PROFUNDA: Os conjuntos de dados serão analisados ​​e processados ​​usando modelos de Aprendizagem Profunda com o objetivo de descobrir padrões significativos que possam ser usados ​​para confirmar e analisar tendências e desenvolver previsões e suporte à decisão sobre a estratificação da DPOC. Técnicas de aumento de dados e otimização automática de hiperparâmetros serão desenvolvidas para melhorar o desempenho da classificação e melhorar a capacidade de generalização. A fim de alcançar uma compensação entre precisão preditiva e interpretabilidade, uma abordagem baseada em mapeamento de ativação de classe (CAM) será aplicada para visualizar as variáveis ​​ativas no espectro a fim de identificar padrões discriminativos para extrair os recursos espectrais mais informativos.

A UNIMIB e o GERA implementarão um mecanismo de explicação para identificar as variáveis ​​ativas em todo o espectro e interpretar as representações de recursos internos e o pipeline de transformação de dados do modelo CNN. O UNIMIB e o GERA integrarão os vários módulos computacionais em um pipeline computacional modular para classificação por paciente.