Kvantifikace produktů na opravu DNA v moči po ultrafialovém záření kůže

Název projektu:

Stanovení produktů opravy DNA v moči po UV ozáření kůže

1. Účel

   Definice problému

   Poškození DNA se tvoří v kůži vystavením slunci. Nejčastější poškození DNA se nazývá thyminové dimery. Mnoho z těchto zranění je opraveno pomocí "Nucleotide excision repair" (NER) a vylučováno močí. Význam tohoto opravného mechanismu je vidět u pacientů s defekty v jejich NER, kteří mají velmi vysoké riziko vzniku rakoviny kůže. Vyšetřovatelé chtějí být schopni kvantifikovat množství thyminových dimerů v moči po ultrafialovém (UV) ozáření kůže. Se zavedením takového testovacího systému bude případně možné testovat potenciální fotoprotektivní látky nebo potenciální fotokarcinogenní látky na základě poškození naměřeného v moči po známé dávce UV záření. Vyšetřovatelé by rádi prozkoumali, kdy dochází k nejvyšší sekreci tohoto typu poškození DNA pomocí dvou různých režimů ozařování. Dříve bylo možné kvantifikovat dimery thyminu v moči pomocí izotopové metody, ale tato metoda již není dostupná a je žádoucí se izotopům vyhnout. Výzkumníci vyvinuli novou metodu založenou na ultra vysokotlaké kapalinové chromatografii-hmotnostní spektrometrii (UHPLC-MS).

   Hypotéza

   Výzkumníci mají hypotézu, že k maximálnímu vylučování dimerů thyminu v moči dochází 1-4 dny po UV ozáření kůže.

   Pozadí

   Ultrafialové (UV) záření způsobuje poškození DNA v kůži, které může nakonec vést k rakovině kůže. Thyminový dimer je poškození DNA, které se tvoří pouze tehdy, když UV paprsky dopadají na DNA v kožních buňkách. Nucleotide excision repair (NER) opravuje a odstraňuje thyminové dimery v jednotlivých buňkách, které jsou pak vylučovány močí. Dimery thyminu v moči jsou biomarkery pro celkovou opravu DNA. V minulosti existovala metoda pro kvantifikaci dimerů thyminu v moči pomocí izotopového značení. Metoda byla velmi citlivá, ale měla dlouhou dobu analýzy a navíc je výhodou z pracovního prostředí vyhnout se práci s radioaktivními izotopy.

   Vyšetřovatelům se podařilo vyvinout novou metodu analýzy pomocí UHPLC-MS. Tato metoda má vysokou citlivost a vysokou selektivitu při rychlém čase analýzy. Kromě toho je toto zařízení schopno analyzovat více modifikací DNA. Dále je zde vysoká citlivost a vysoká selektivita. Tato studie je studií proof-of-concept, ve které by výzkumníci rádi prozkoumali, kdy je nejoptimálnější doba pro sběr moči po dvou různých režimech ozařování. Perspektiva je umět pomocí metody najít nové potenciální fotoprotektivní i fotokarcinogenní látky.

2. Metoda

   Návrh studie pro zdravé subjekty

   Subjekty (n = 16-20) jsou přijímány na základě oznámení na webových stránkách Bispebjergovy nemocnice. Subjekty budou pozvány na úvodní screeningovou návštěvu, kde účastníci obdrží ústní informace o studii vedoucí studie Catharina Lerche. Setkání probíhá v oddělené místnosti, aby bylo zajištěno bezpečné a tiché prostředí. Subjekty budou informovány, že si účastníci mohou na přání přivést asistenta. Bude zajištěn písemný informovaný souhlas, který se uskuteční nejpozději 24 hodin po screeningové návštěvě.

   Na základě toho jsou subjekty rozděleny do 2 skupin po 8-10 osobách. Skupina 1 je ozářena 3krát 1 standardní dávkou erytému (SED). 1 SED odpovídá cca. 10 min slunce kolem kl. 13 za dobrého dánského letního dne. Skupina 2 je ozářena jednou 3 SED, což odpovídá cca. 30 min kolem kl. 13 za dobrého dánského letního dne. Ozařování se provádí v den 1 pro skupinu 2 a dny 1, 2 a 3 pro skupinu 1.

   Subjekty jsou ozařovány v celotělové UV kabině (Waldmann, Willing-Schwenningen, Německo) s 26 F85 / 100W UV6 trubicemi (290-350 nm, široké spektrum). Doba ozařování je nastavena na časovačích tak, aby se UV kabina po požadované době ozařování vypnula. Doba ozařování je 16 sekund pro 1 SED a 43 sekund pro 3 SED. UV kabina je měřena pomocí kalibrovaného zařízení, které se používá i pro měření UV kabin na klinice, které slouží pro pacienty. Subjekty se postaví v kabině a mají zapnutou obrazovku, aby jejich oči a obličej nebyly vystaveny záření. Při svícení by subjekty měly nosit pouze spodní prádlo, což jsou pro muže spodky/boxerky, zatímco pro ženy jsou to podprsenky a kalhotky. Experiment se provádí mezi říjnem a březnem, aby se zabránilo tomu, že subjekty současně nedostávají UV záření ze slunce a mohou tak poškodit DNA. Subjekty musí sbírat ranní moč do dávkovaných nádob a musí ji skladovat ve svém vlastním mrazáku až do poslední návštěvy.

   Ranní moč (2x 50 ml) se odebírá před ozářením, tzv. 1. den a dokonce až 8. den po posledním ozáření, tzn. den 10 pro skupinu 1 a den 8 pro skupinu 2. 2 x 50 ml x 10 celkem 1000 ml moči pro skupinu 1 a 2 x 50 ml x 8 celkem 800 ml moči pro skupinu 2. Před a po každé osvětlení je měřeno pigmentem a zarudnutím u subjektů i při závěrečných návštěvách. Měření pigmentu a zarudnutí se provádí na zádech, hrudníku a hýždích.

3. Statistické úvahy

   Předchozí studie pozorovaly zvýšení o 1,7 nmol s rozptylem (SD) 1,3 nmol 4, mocninou 0,80, stejně jako hladinou významnosti 0,05 v párovém testu, poté musí studii dokončit 7 lidí, když vyšetřovatelé nastaví sílu na 0,80 a mají hladinu významnosti 0,05 a použijte párový test (Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; verze 3.1.2). Jelikož studium trvá do 10 dnů, lze očekávat výpadky, a proto je do každé ze dvou skupin zařazeno 8-10, tzn. celkem 16-20 zdravých subjektů.

4. Rizika, vedlejší účinky a nevýhody v krátkodobém i dlouhodobém horizontu

   Mírně hrozí krátkodobé zarudnutí po nasvícení, stejně jako po pobytu na slunci. Dávky UV (3 SED) byly zvoleny tak, aby se téměř všichni Dánové vyhli zarudnutí. Celková dávka UV záření odpovídá půlhodinovému pobytu na slunci uprostřed dne v létě v Dánsku. Všechny subjekty budou o rizicích a možných vedlejších účincích informovány ústně i písemně.

   Žádná biobanka nevznikne. Vzorky moči se analyzují ihned po odběru. Přebytečný biologický materiál je ihned po analýze zničen.

5. Kontrola kvality

   Helsinská deklarace II bude respektována stejně jako standardy dobrého klinického výzkumu. Respektování soukromí i fyzické a duševní integrity pacientů je zachováno. Studie bude registrována ve Znalostním centru pro vykazování dat, Kraj hl. m., v elektronickém systému Pactius.

6. Ochrana a uchovávání údajů Bude respektováno obecné nařízení o ochraně údajů. Výzkum využívající data z regionu hlavního města je považován za veřejný výzkum. Použití a distribuce dat shromážděných v této studii bude prodiskutována s pacienty během procesu souhlasu. Projekt je hlášen do Centra znalostí pro hlášení dat v regionu hlavního města Dánska v elektronickém systému Pactius. Je připraven seznam jmen subjektů, studijní ID a datum narození. Všechny shromážděné údaje budou anonymizovány a chráněny dánskou legislativou týkající se nakládání s osobními údaji a zákonem o zdraví. Data jsou registrována a uchovávána po dobu 5 let po ukončení studie na kožním oddělení nemocnice Bispebjerg.
7. Ekonomika Iniciativu experimentu převzali farmaceutka Catharina Lerche, profesor Hans Christian Wulf a inženýr Peter Philipsen a všichni vyšetřovatelé jsou placeni kožním oddělením nemocnice Bispebjerg. Na tento experiment nejsou žádné příspěvky od společností ani externích fondů.
8. Informace pro subjekty Hlavní řešitelka, Catharina M. Lerche, je zodpovědná za poskytování jasných ústních a písemných informací o cílech, plánech a rizicích studie, jak je uvedeno v části „Informace a souhlas s účastí na projektech zdravotnického výzkumu“ Ministerstvo zdravotnictví a seniorů. Účastník bude v nerušeném prostředí upozorněn na své právo na přítomnost jednoho/nebo více účastníků, že účast je dobrovolná a že je možné kdykoli v průběhu studie odstoupit. Subjektům je poskytnut dostatečný čas na reflexi (alespoň 24 hodin). Subjekty budou požádány, aby podepsaly formulář souhlasu.
9. Zveřejnění výsledků Budou zveřejněny pozitivní, negativní a průkazné výsledky. Cílem je publikovat a prezentovat výsledky v recenzovaném mezinárodním dermatologickém časopise a/nebo na dermatologických konferencích. Práva duševního vlastnictví k výsledkům patří nemocnici Bispebjerg. Publikace budou v souladu s Vancouver Guidelines.
10. Etika Osobní údaje a vzorky moči jsou zpracovávány v souladu se zákonem o osobních údajích a zákonem o zdraví. Projekt je také realizován s minimálními zdravotními a bezpečnostními riziky pro účastníky. Očekává se, že potenciální rizika nežádoucích účinků v této studii jsou velmi malá. Potenciál budoucích zisků založených na důkazech a budoucí perspektivy, které tato studie může poskytnout, by měly být porovnány s účastí ve studii. Jsou dodržovány dánské zákony o právech pacientů a náhradách.