Количественное определение продуктов репарации ДНК в моче после ультрафиолетового облучения кожи

Название Проекта:

Определение продуктов репарации ДНК в моче после УФ-облучения кожи

1. Цель

   Определение проблемы

   Повреждения ДНК образуются в коже под воздействием солнца. Наиболее распространенные повреждения ДНК называются димерами тимина. Многие из этих повреждений восстанавливаются с помощью «эксцизионной репарации нуклеотидов» (NER) и выводятся с мочой. Важность этого механизма репарации проявляется у пациентов с дефектами NER, у которых очень высокий риск развития рака кожи. Исследователи хотят иметь возможность количественно определить количество димеров тимина в моче после ультрафиолетового (УФ) облучения кожи. С созданием такой тест-системы в конечном итоге можно будет тестировать потенциальные фотозащитные вещества или потенциальные фотоканцерогенные вещества на основе повреждений, измеренных в моче после известной дозы УФ-излучения. Исследователи хотели бы выяснить, когда происходит самая высокая секреция этого типа повреждения ДНК с использованием двух разных режимов облучения. Ранее можно было количественно определять димеры тимина в моче с помощью изотопного метода, но этот метод больше недоступен, и желательно избегать использования изотопов. Исследователи разработали новый метод, основанный на жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии сверхвысокого давления (UHPLC-MS).

   Гипотеза

   У исследователей есть гипотеза, что максимальная экскреция димеров тимина с мочой происходит через 1-4 дня после УФ-облучения кожи.

   Задний план

   Ультрафиолетовое (УФ) излучение вызывает повреждение ДНК в коже, что в конечном итоге может привести к раку кожи. Димер тимина представляет собой повреждение ДНК, которое образуется только тогда, когда ультрафиолетовые лучи попадают на ДНК в клетках кожи. Эксцизионная репарация нуклеотидов (NER) восстанавливает и удаляет димеры тимина в отдельной клетке, которые затем выводятся с мочой. Димеры тимина в моче являются биомаркером полной репарации ДНК. В прошлом существовал метод количественного определения димеров тимина в моче с использованием изотопной метки. Этот метод был очень чувствительным, но имел длительное время анализа, и, кроме того, преимуществом рабочей среды является отсутствие работы с радиоактивными изотопами.

   Исследователям удалось разработать новый метод анализа с использованием УВЭЖХ-МС. Этот метод обладает высокой чувствительностью и высокой селективностью при малом времени анализа. Кроме того, это оборудование способно анализировать несколько модификаций ДНК. Кроме того, существует высокая чувствительность и высокая селективность. Это исследование является проверкой концепции, в котором исследователи хотели бы выяснить, когда наиболее оптимальное время для сбора мочи наступает после двух разных режимов облучения. Перспектива состоит в том, чтобы иметь возможность использовать этот метод для поиска новых потенциальных фотозащитных, а также фотоканцерогенных веществ.

2. Метод

   Дизайн исследования для здоровых субъектов

   Субъекты (n = 16-20) набираются по уведомлению на веб-сайте больницы Биспебьерг. Субъекты будут приглашены на первоначальный скрининговый визит, во время которого участники получат устную информацию об исследовании от руководителя исследования Катарины Лерче. Встреча проходит в отдельной комнате, чтобы обеспечить безопасную и спокойную обстановку. Субъекты будут проинформированы о том, что при желании участники могут привести с собой помощника. Письменное информированное согласие будет обеспечено и состоится не менее чем через 24 часа после скринингового визита.

   Исходя из этого, испытуемые делятся на 2 группы по 8-10 человек. 1-я группа облучается 3 раза по 1 стандартной эритемной дозе (СЭД). 1 SED соответствует прибл. 10 мин солнце около кл. 13 в хороший датский летний день. Группа 2 облучается однократно с 3 SED, что соответствует прибл. 30 мин вокруг кл. 13 в хороший датский летний день. Облучение проводят в 1-й день для 2-й группы и 1-й, 2-й и 3-й дни для 1-й группы.

   Субъекты облучаются в УФ-кабине для всего тела (Waldmann, Willing-Schwenningen, Germany) с помощью 26 ламп F85/100 Вт UV6 (290–350 нм, широкий спектр). Время облучения устанавливается на таймере таким образом, чтобы УФ-кабина выключалась по истечении желаемого времени облучения. Время облучения составляет 16 секунд для 1 SED и 43 секунды для 3 SED. УФ-кабина измеряется с помощью калиброванного оборудования, которое также используется для измерения УФ-кабин в клинике, которые используются для пациентов. Испытуемые встают в кабине и включают экран, чтобы их глаза и лицо не подвергались воздействию радиации. При освещении испытуемые должны быть одеты только в нижнее белье, которым для мужчин являются трусы/трусы-боксеры, а для женщин – бюстгальтеры и трусики. Эксперимент проводится в период с октября по март, чтобы избежать одновременного получения испытуемыми УФ-излучения от солнца и, таким образом, повреждения ДНК. Субъекты должны собирать утреннюю мочу в выданные контейнеры и хранить ее в собственном морозильнике до последнего визита.

   Утреннюю мочу (2х50 мл) собирают до облучения, называемого 1-м днем ​​и даже до 8-го дня после последнего облучения, т.е. день 10 для группы 1 и день 8 для группы 2. 2 х 50 мл х 10, всего 1000 мл мочи собирается для группы 1 и 2 х 50 мл х 8, всего 800 мл мочи для группы 2. До и после при каждом освещении измеряются пигмент и покраснение на субъектах, а также во время последних посещений. Измерения пигмента и покраснения выполняются на спине, груди и ягодицах.

3. Статистические соображения

   Предыдущие исследования наблюдали увеличение на 1,7 нмоль при рассеянии (SD) 1,3 нмоль 4 , мощности 0,80, а также уровне значимости 0,05 в парном тесте, тогда 7 человек должны завершить исследование, когда исследователи устанавливают мощность на 0,80 и иметь уровень значимости 0,05 и использовать парный тест (Расчет мощности и размера выборки, PS, Университет Вандербильта; версия 3.1.2). Поскольку исследование длится до 10 дней, можно ожидать отсева, поэтому в каждую из двух групп включают 8-10 человек, т.е. всего 16-20 здоровых испытуемых.

4. Риски, побочные эффекты и недостатки в краткосрочной и долгосрочной перспективе

   Есть небольшой риск кратковременного покраснения после освещения, а также после пребывания на солнце. Дозы УФ-излучения (3 SED) были выбраны таким образом, чтобы почти все датчане избегали покраснения. Общая доза УФ-излучения соответствует полуторачасовому пребыванию на солнце в середине дня летом в Дании. Все субъекты будут проинформированы как в устной, так и в письменной форме о рисках и возможных побочных эффектах.

   Биобанк создаваться не будет. Образцы мочи анализируют сразу после сбора. Избыток биологического материала уничтожается сразу после анализа.

5. Контроль качества

   Будет соблюдаться Хельсинкская декларация II, а также стандарты хороших клинических исследований. Соблюдается уважение к частной жизни, а также к физической и психической неприкосновенности пациентов. Исследование будет зарегистрировано в Центре знаний по отчетности Столичного региона в электронной системе Pactius.

6. Защита и хранение данных Будут соблюдаться общие положения о защите данных. Исследование с использованием данных из столичного региона считается публичным исследованием. Использование и распространение данных, собранных в этом исследовании, будет обсуждаться с пациентами в процессе получения согласия. Информация о проекте сообщается в Центр знаний по отчетности столичного региона Дании в электронной системе Pactius. Подготавливается список имен субъектов, идентификационный номер исследования и дата рождения. Все собранные данные будут обезличены и защищены законодательством Дании в отношении обработки персональных данных и Законом о здравоохранении. Данные регистрируются и хранятся в течение 5 лет после завершения исследования в отделении дерматологии больницы Биспебьерг.
7. Экономика Инициативу проведения эксперимента взяли на себя фармацевт Катарина Лерхе, профессор Ханс Кристиан Вульф и инженер Петер Филипсен, а всем исследователям платит кожное отделение больницы Биспебьерг. В этом эксперименте нет взносов от компаний или внешних фондов.
8. Информация для испытуемых Главный исследователь, Катарина М. Лерче, несет ответственность за предоставление четкой устной и письменной информации о целях, дизайне и рисках исследования, как указано в разделе «Информация и согласие на участие в научно-исследовательских проектах в области здравоохранения» Министерство здравоохранения и пожилых людей. В спокойной обстановке участнику будет сообщено о его праве на присутствие одного или нескольких сопровождающих лиц, о том, что участие является добровольным и что выход из него возможен в любое время во время исследования. Испытуемым дается достаточно времени на размышление (не менее 24 часов). Субъектам будет предложено подписать форму согласия.
9. Публикация результатов Положительные, отрицательные и окончательные результаты будут опубликованы. Цель состоит в том, чтобы опубликовать и представить результаты в рецензируемом международном журнале по дерматологии и/или на дерматологических конференциях. Права интеллектуальной собственности на результаты принадлежат больнице Биспебьерг. Публикации будут соответствовать Ванкуверским руководящим принципам.
10. Этика Личная информация и образцы мочи обрабатываются в соответствии с Законом о персональных данных и Законом о здоровье. Проект также реализуется с минимальными рисками для здоровья и безопасности участников. Ожидается, что потенциальные риски побочных эффектов в этом исследовании очень малы. Потенциал будущих достижений, основанных на фактических данных, и перспективы на будущее, которые может предоставить это исследование, следует сопоставлять с участием в испытаниях. Датские законы о правах пациентов и компенсациях соблюдаются.