Quantificazione dei prodotti di riparazione del DNA nelle urine dopo la radiazione ultravioletta della pelle

Titolo del progetto:

Determinazione dei prodotti di riparazione del DNA nelle urine dopo irradiazione UV della pelle

1. Scopo

   Definizione del problema

   Il danno al DNA si forma nella pelle a causa dell'esposizione al sole. Il danno al DNA più comune è chiamato dimeri di timina. Molte di queste lesioni vengono riparate dalla "riparazione dell'escissione di nucleotidi" (NER) ed escrete attraverso l'urina. L'importanza di questo meccanismo di riparazione è evidente nei pazienti con difetti nel loro NER, che hanno un rischio molto elevato di sviluppare il cancro della pelle. I ricercatori vogliono essere in grado di quantificare la quantità di dimeri di timina nelle urine dopo l'irradiazione ultravioletta (UV) della pelle. Con l'istituzione di un tale sistema di test, sarà finalmente possibile testare potenziali sostanze fotoprotettive o potenziali sostanze fotocancerogene sulla base del danno misurato nelle urine dopo una dose nota di UV. Gli investigatori vorrebbero indagare quando si verifica la più alta secrezione di questo tipo di danno al DNA utilizzando due diversi regimi di irradiazione. In precedenza era possibile quantificare i dimeri di timina nelle urine utilizzando un metodo isotopico, ma tale metodo non è più disponibile ed è auspicabile evitare gli isotopi. I ricercatori hanno sviluppato un nuovo metodo basato sulla spettrometria di massa con cromatografia liquida ad altissima pressione (UHPLC-MS).

   Ipotesi

   I ricercatori ipotizzano che la massima escrezione di dimeri di timina nelle urine si verifichi 1-4 giorni dopo l'irradiazione UV della pelle.

   Sfondo

   Le radiazioni ultraviolette (UV) provocano danni al DNA della pelle che alla fine possono portare al cancro della pelle. Il dimero di timina è un danno al DNA che si forma solo quando i raggi UV colpiscono il DNA nelle cellule della pelle. La riparazione per escissione nucleotidica (NER) ripara e rimuove i dimeri di timina nella singola cellula, che vengono poi escreti nelle urine. I dimeri di timina nelle urine sono un biomarcatore per la riparazione totale del DNA. In passato esisteva un metodo per quantificare i dimeri di timina nelle urine utilizzando l'etichettatura degli isotopi. Il metodo era molto sensibile ma aveva un lungo tempo di analisi e inoltre è un vantaggio da un ambiente di lavoro evitare di lavorare con isotopi radioattivi.

   I ricercatori sono riusciti a sviluppare un nuovo metodo di analisi utilizzando UHPLC-MS. Questo metodo ha un'elevata sensibilità e un'elevata selettività pur avendo un tempo di analisi veloce. Inoltre, questa apparecchiatura è in grado di analizzare molteplici modifiche del DNA. Inoltre, vi è un'elevata sensibilità e un'elevata selettività. Questo studio è uno studio di prova in cui i ricercatori vorrebbero indagare quando il momento ottimale per la raccolta delle urine è dopo due diversi regimi di irradiazione. La prospettiva è quella di poter utilizzare il metodo per trovare nuove potenziali sostanze fotoprotettive e fotocancerogene.

2. Metodo

   Disegno dello studio per soggetti sani

   I soggetti (n = 16-20) sono reclutati da un avviso sul sito web dell'ospedale di Bispebjerg. I soggetti saranno invitati a una visita di screening iniziale in cui i partecipanti riceveranno informazioni orali sullo studio dal supervisore dello studio Catharina Lerche. L'incontro si svolge in una stanza separata per garantire un ambiente sicuro e tranquillo. I soggetti saranno informati che i partecipanti possono portare un assistente se lo desiderano. Sarà garantito il consenso informato scritto, che avrà luogo almeno 24 ore dopo la visita di screening.

   Sulla base di ciò, i soggetti sono divisi in 2 gruppi di 8-10 persone. Il gruppo 1 viene irradiato 3 volte con 1 dose standard di eritema (SED). 1 SED corrisponde a ca. 10 min sole intorno kl. 13 in una bella giornata estiva danese. Il gruppo 2 viene irradiato una volta con 3 SED, che corrisponde a ca. 30 min circa kl. 13 in una bella giornata estiva danese. L'irradiazione viene eseguita il giorno 1 per il gruppo 2 e i giorni 1, 2 e 3 per il gruppo 1.

   I soggetti vengono irradiati in una cabina UV a corpo intero (Waldmann, Willing-Schwenningen, Germania) con 26 tubi UV6 F85 / 100W (290-350 nm, ampio spettro). Il tempo di irraggiamento viene impostato su un timer in modo che la cabina UV si spenga dopo il tempo di irraggiamento desiderato. Il tempo di irradiazione è di 16 secondi per 1 SED e 43 secondi per 3 SED. La cabina UV viene misurata utilizzando un'apparecchiatura calibrata, utilizzata anche per misurare le cabine UV nella clinica, utilizzate per i pazienti. I soggetti si alzano in piedi nella cabina e hanno uno schermo acceso in modo che i loro occhi e il viso non siano esposti alle radiazioni. Durante l'illuminazione, i soggetti devono indossare solo biancheria intima, che per gli uomini sono mutande/boxer, mentre per le donne sono reggiseni e mutandine. L'esperimento viene eseguito tra ottobre e marzo, per evitare che i soggetti non ricevano contemporaneamente radiazioni UV dal sole e quindi possano formare danni al DNA. I soggetti devono raccogliere l'urina del mattino in contenitori dispensati e devono conservarla nel proprio congelatore fino alla visita finale.

   L'urina del mattino (2x 50 ml) viene raccolta prima dell'irradiazione, chiamata giorno 1 e anche fino al giorno 8 dopo l'ultima irradiazione, cioè. giorno 10 per il gruppo 1 e giorno 8 per il gruppo 2. Si raccolgono 2 x 50 ml x 10 in totale 1000 ml di urina per il gruppo 1 e 2 x 50 ml x 8 per un totale di 800 ml di urina per il gruppo 2. Prima e dopo ad ogni illuminazione vengono misurati pigmento e rossore sui soggetti così come nelle visite finali. Le misurazioni del pigmento e del rossore vengono eseguite su schiena, petto e glutei.

3. Considerazioni statistiche

   Precedenti studi hanno osservato un aumento di 1,7 nmol con uno scattering (SD) di 1,3 nmol 4, potenza di 0,80 e un livello di significatività di 0,05 in un test accoppiato, quindi 7 persone devono completare lo studio quando i ricercatori impostano il potere su 0,80 e hanno un livello di significatività di 0,05 e utilizzano il test accoppiato (Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; versione 3.1.2). Poiché lo studio dura fino a 10 giorni, si possono prevedere abbandoni e quindi 8-10 sono inclusi in ciascuno dei due gruppi, ad es. un totale di 16-20 soggetti sani.

4. Rischi, effetti collaterali e svantaggi a breve e lungo termine

   C'è un leggero rischio di arrossamento a breve termine dopo l'illuminazione, così come dopo essere stati al sole. Le dosi UV (3 SED) sono state scelte in modo che quasi tutti i danesi evitino arrossamenti. La dose totale di UV corrisponde a una permanenza di mezz'ora al sole in pieno giorno durante l'estate in Danimarca. Tutti i soggetti saranno informati sia oralmente che per iscritto sui rischi e sui possibili effetti collaterali.

   Non verrà creata alcuna biobanca. I campioni di urina vengono analizzati immediatamente dopo la raccolta. Il materiale biologico in eccesso viene distrutto immediatamente dopo l'analisi.

5. Controllo di qualità

   La Dichiarazione di Helsinki II sarà rispettata così come gli standard di una buona ricerca clinica. Viene mantenuto il rispetto della privacy e dell'integrità fisica e mentale dei pazienti. Lo studio sarà registrato presso il Centro di Conoscenza per la Segnalazione dei Dati, Regione Capitale, nel sistema telematico Pactius.

6. Protezione dei dati e conservazione Sarà rispettato il regolamento generale sulla protezione dei dati. La ricerca che utilizza i dati della regione della capitale è considerata ricerca pubblica. L'uso e la distribuzione dei dati raccolti in questo studio saranno discussi con i pazienti durante il processo di consenso. Il progetto è segnalato al Knowledge Center for Data Reporting, la regione della capitale della Danimarca nel sistema elettronico Pactius. Viene preparato un elenco dei nomi dei soggetti, dell'ID dello studio e della data di nascita. Tutti i dati raccolti saranno resi anonimi e protetti dalla legislazione danese in materia di trattamento dei dati personali e dalla legge sulla salute. I dati sono registrati e conservati per 5 anni dopo il completamento dello studio presso il Dipartimento di Dermatologia, Bispebjerg Hospital.
7. Economia Sono la farmacista Catharina Lerche, il professor Hans Christian Wulf e l'ingegnere Peter Philipsen che hanno preso l'iniziativa per l'esperimento, e gli investigatori sono tutti pagati dal dipartimento di pelle, ospedale di Bispebjerg. Per questa sperimentazione non sono previsti contributi di aziende o fondi esterni.
8. Informazioni per i soggetti Il ricercatore principale, Catharina M. Lerche, è responsabile di fornire chiare informazioni orali e scritte sugli obiettivi, i disegni e i rischi dello studio, come indicato in "Informazioni e consenso a partecipare a progetti di ricerca in scienze della salute" dal Ministero della Salute e degli Anziani. In un ambiente indisturbato, il partecipante sarà informato del proprio diritto alla presenza di uno / o più assistenti, che la partecipazione è volontaria e che il recesso è possibile in qualsiasi momento durante lo studio. Ai soggetti viene concesso un tempo di riflessione sufficiente (almeno 24 ore). Ai soggetti verrà chiesto di firmare un modulo di consenso.
9. Pubblicazione dei risultati I risultati positivi, negativi e conclusivi saranno pubblicati. L'obiettivo è pubblicare e presentare i risultati in una rivista internazionale di dermatologia sottoposta a revisione paritaria e/o in occasione di conferenze dermatologiche. I diritti di proprietà intellettuale sui risultati appartengono all'ospedale Bispebjerg. Le pubblicazioni rispetteranno le linee guida di Vancouver.
10. Etica Le informazioni personali ei campioni di urina vengono elaborati in conformità con la legge sui dati personali e la legge sulla salute. Il progetto è inoltre attuato con rischi minimi per la salute e la sicurezza dei partecipanti. Si prevede che i potenziali rischi di effetti avversi in questo studio siano molto ridotti. Il potenziale per guadagni futuri basati sull'evidenza e le prospettive future che questo studio può fornire dovrebbero essere valutati rispetto alla partecipazione allo studio. Vengono seguite le leggi danesi sui diritti e il risarcimento dei pazienti.