Kvantifisering av DNA-reparasjonsprodukter i urinen etter ultrafiolett stråling av huden

Prosjekt tittel:

Bestemmelse av DNA-reparasjonsprodukter i urin etter UV-bestråling av huden

1. Hensikt

   Problemdefinisjon

   DNA-skader dannes i huden ved soleksponering. Den vanligste DNA-skaden kalles tymin-dimerer. Mange av disse skadene repareres ved "Nucleotide excision repair" (NER) og skilles ut gjennom urinen. Betydningen av denne reparasjonsmekanismen sees hos pasienter med defekter i NER, som har svært høy risiko for å utvikle hudkreft. Etterforskerne ønsker å kunne kvantifisere mengden tymin-dimerer i urinen etter ultrafiolett (UV) bestråling av huden. Ved etablering av et slikt testsystem vil det på sikt være mulig å teste potensielle fotobeskyttende stoffer eller potensielle fotokreftfremkallende stoffer basert på skader målt i urinen etter en kjent UV-dose. Etterforskerne ønsker å undersøke når den høyeste sekresjonen av denne typen DNA-skader oppstår ved bruk av to forskjellige bestrålingsregimer. Det har tidligere vært mulig å kvantifisere tymin-dimerer i urinen ved hjelp av en isotopmetode, men den metoden er ikke lenger tilgjengelig og det er ønskelig å unngå isotoper. Etterforskerne har utviklet en ny metode basert på Ultra High-pressure Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UHPLC-MS).

   Hypotese

   Etterforskerne har den hypotesen at maksimal utskillelse av tymin-dimerer i urinen skjer 1-4 dager etter UV-bestråling av huden.

   Bakgrunn

   Ultrafiolett (UV) stråling forårsaker DNA-skader i huden som til slutt kan føre til hudkreft. Thymindimer er en DNA-skade som bare dannes når UV-stråler treffer DNA i hudcellene. Nucleotide excision repair (NER) reparerer og fjerner tymin-dimerer i den enkelte celle, som deretter skilles ut i urinen. Tymin-dimerer i urinen er en biomarkør for total DNA-reparasjon. Tidligere har det eksistert en metode for å kvantifisere tymin-dimerer i urin ved bruk av isotopmerking. Metoden var svært sensitiv men hadde lang analysetid og i tillegg er det en fordel fra et arbeidsmiljø å slippe å arbeide med radioaktive isotoper.

   Etterforskerne har lykkes med å utvikle en ny analysemetode ved bruk av UHPLC-MS. Denne metoden har høy sensitivitet og høy selektivitet samtidig som den har en rask analysetid. I tillegg er dette utstyret i stand til å analysere flere DNA-modifikasjoner. Videre er det høy sensitivitet og høy selektivitet. Denne studien er en proof-of-concept-studie der etterforskerne ønsker å undersøke når det mest optimale tidspunktet for urininnsamling er etter to forskjellige bestrålingsregimer. Perspektivet er å kunne bruke metoden til å finne nye potensielle fotobeskyttende så vel som fotokreftfremkallende stoffer.

2. Metode

   Studiedesign for friske forsøkspersoner

   Forsøkspersonene (n = 16-20) rekrutteres ved oppslag på Bispebjergs sykehus nettside. Forsøkspersonene vil bli invitert til et første screeningbesøk hvor deltakerne vil motta muntlig informasjon om studien av studieveileder Catharina Lerche. Møtet foregår i eget rom for å sikre trygge og rolige omgivelser. Forsøkspersoner vil bli informert om at deltakere kan ta med assistent om ønskelig. Skriftlig informert samtykke vil være sikret, og skjer minst 24 timer etter screeningbesøket.

   Ut fra dette deles fagene inn i 2 grupper på 8-10 personer. Gruppe 1 bestråles 3 ganger med 1 standard erytemdose (SED). 1 SED tilsvarer ca. 10 min sol rundt kl. 13 en god dansk sommerdag. Gruppe 2 bestråles én gang med 3 SED, som tilsvarer ca. 30 min rundt kl. 13 en god dansk sommerdag. Bestrålingen utføres på dag 1 for gruppe 2 og dag 1, 2 og 3 for gruppe 1.

   Forsøkene blir bestrålt i en helkropps UV-kabin (Waldmann, Willing-Schwenningen, Tyskland) med 26 F85 / 100W UV6-rør (290-350 nm, bredspektret). Bestrålingstiden stilles inn på et tidsur slik at UV-kabinen slår seg av etter ønsket bestrålingstid. Bestrålingstiden er 16 sekunder for en 1 SED og 43 sekunder for en 3 SED. UV-hytta måles ved hjelp av kalibrert utstyr, som også brukes til å måle UV-hytter i klinikken, som brukes til pasienter. Forsøkspersonene står opp i kabinen og har skjerm på slik at øynene og ansiktet ikke utsettes for stråling. Ved belysning skal forsøkspersoner kun bruke undertøy, som for menn er underbukser/boksershorts, mens det for kvinner er bh og truser. Forsøket utføres mellom oktober og mars, for å unngå at forsøkspersonene ikke samtidig får UV-stråling fra solen og dermed kan danne DNA-skader. Forsøkspersonene må samle morgenurin i dispenserte beholdere og må oppbevare den i egen fryser frem til siste besøk.

   Morgenurin (2x 50 ml) samles opp før bestråling, kalt dag 1 og til og med til dag 8 etter siste bestråling, dvs. dag 10 for gruppe 1 og dag 8 for gruppe 2. 2 x 50 ml x 10 totalt samles 1000 ml urin for gruppe 1 og 2 x 50 ml x 8 totalt 800 ml urin for gruppe 2. Før og etter hver belysning måles pigment og rødhet på forsøkspersonene så vel som ved siste besøk. Pigment- og rødhetsmålinger utføres på rygg, bryst og rumpe.

3. Statistiske betraktninger

   Tidligere studier har observert en økning på 1,7 nmol med en spredning (SD) på 1,3 nmol 4, kraft på 0,80, samt signifikansnivå på 0,05 i en paret test, deretter må 7 personer fullføre studien når etterforskerne setter kraften til 0,80 og har et signifikansnivå på 0,05 og bruker den sammenkoblede testen (Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; versjon 3.1.2). Ettersom studien varer inntil 10 dager kan det forventes frafall, og derfor inngår 8-10 i hver av de to gruppene, dvs. totalt 16-20 friske forsøkspersoner.

4. Risikoer, bivirkninger og ulemper på kort og lang sikt

   Det er en liten risiko for kortvarig rødhet etter tenning, samt etter opphold i solen. UV-dosene (3 SED) er valgt slik at nesten alle dansker skal unngå rødhet. Den totale UV-dosen tilsvarer ½ times opphold i solen midt på dagen om sommeren i Danmark. Alle forsøkspersoner vil bli informert både muntlig og skriftlig om risikoen og mulige bivirkninger.

   Ingen biobank vil bli opprettet. Urinprøvene analyseres umiddelbart etter innsamling. Overskytende biologisk materiale destrueres umiddelbart etter analyse.

5. Kvalitetskontroll

   Helsinki II-erklæringen vil bli respektert så vel som standardene for god klinisk forskning. Respekten for personvernet samt for fysisk og mental integritet hos pasientene opprettholdes. Studiet vil bli registrert ved Kunnskapssenteret for datarapportering, Region Hovedstaden, i det elektroniske systemet Pactius.

6. Databeskyttelse og lagring Den generelle databeskyttelsesforskriften vil bli respektert. Forskning med data fra hovedstadsregionen regnes som offentlig forskning. Bruk og distribusjon av data samlet inn i denne studien vil bli diskutert med pasienter under samtykkeprosessen. Prosjektet rapporteres til Kunnskapssenteret for datarapportering, Region Hovedstaden i det elektroniske systemet Pactius. Det utarbeides en liste over forsøkspersonenes navn, studie-ID og fødselsdato. Alle innsamlede data vil bli anonymisert og beskyttet av dansk lovgivning angående håndtering av personopplysninger og helseloven. Data registreres og lagres i 5 år etter avsluttet studie ved Hudavdelingen, Bispebjerg Hospital.
7. Økonomi Det er farmasøyt Catharina Lerche, professor Hans Christian Wulf og ingeniør Peter Philipsen som har tatt initiativet til forsøket, og etterforskerne er alle betalt av hudavdelingen, Bispebjerg hospital. Det er ingen bidrag fra selskaper eller eksterne fond til dette forsøket.
8. Informasjon til forsøkspersoner Hovedetterforskeren, Catharina M. Lerche, er ansvarlig for å gi tydelig muntlig og skriftlig informasjon om målene, designene og risikoene ved studien, som angitt i "Informasjon og samtykke til å delta i helsevitenskapelige forskningsprosjekter" av Helse- og eldredepartementet. I uforstyrrede omgivelser vil deltakeren bli gjort oppmerksom på sin rett til å ha en/eller flere ledsagere til stede, at deltakelsen er frivillig og at det er mulig å trekke seg når som helst i løpet av studiet. Forsøkspersonene får tilstrekkelig refleksjonstid (minst 24 timer). Deltakerne vil bli bedt om å signere et samtykkeskjema.
9. Publisering av resultater Positive, negative og avgjørende resultater vil bli publisert. Målet er å publisere og presentere resultatene i et fagfellevurdert internasjonalt dermatologisk tidsskrift og/eller på dermatologiske konferanser. De immaterielle rettighetene til resultatene tilhører Bispebjerg Hospital. Publikasjoner vil være i samsvar med Vancouver-retningslinjene.
10. Etikk Personopplysninger og urinprøver behandles i henhold til personopplysningsloven og helseloven. Prosjektet gjennomføres også med minimal helse- og sikkerhetsrisiko for deltakerne. Det forventes at den potensielle risikoen for uønskede effekter i denne studien er svært liten. Potensialet for evidensbaserte fremtidige gevinster og fremtidsperspektivene som denne studien kan gi bør veies opp mot prøvedeltakelse. Danske lover om pasientrettigheter og erstatning følges.