Kwantificering van DNA-reparatieproducten in de urine na ultraviolette straling van de huid

Project titel:

Bepaling van DNA-herstelproducten in urine na UV-bestraling van de huid

1. Doel

   Probleem definitie

   Door blootstelling aan de zon ontstaat DNA-schade in de huid. De meest voorkomende DNA-schade wordt thyminedimeren genoemd. Veel van deze verwondingen worden gerepareerd door "Nucleotide-excisieherstel" (NER) en uitgescheiden via de urine. Het belang van dit herstelmechanisme wordt gezien bij patiënten met defecten in hun NER, die een zeer hoog risico lopen op het ontwikkelen van huidkanker. De onderzoekers willen de hoeveelheid thyminedimeren in de urine kunnen kwantificeren na ultraviolette (UV) bestraling van de huid. Met de oprichting van zo'n testsysteem zal het op termijn mogelijk zijn om potentiële fotoprotectieve stoffen of potentiële fotocarcinogene stoffen te testen op basis van schade gemeten in de urine na een bekende UV-dosis. De onderzoekers willen onderzoeken wanneer de hoogste uitscheiding van dit type DNA-schade optreedt met behulp van twee verschillende bestralingsregimes. Het was voorheen mogelijk om thyminedimeren in de urine te kwantificeren met behulp van een isotopenmethode, maar die methode is niet meer beschikbaar en het is wenselijk om isotopen te vermijden. De onderzoekers hebben een nieuwe methode ontwikkeld op basis van Ultra High-pressure Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UHPLC-MS).

   Hypothese

   De onderzoekers hebben de hypothese dat de maximale uitscheiding van thyminedimeren in de urine 1-4 dagen na UV-bestraling van de huid plaatsvindt.

   Achtergrond

   Ultraviolette (UV) straling veroorzaakt DNA-schade in de huid die uiteindelijk kan leiden tot huidkanker. Thymine-dimeer is een DNA-beschadiging die alleen wordt gevormd wanneer UV-stralen DNA in de huidcellen raken. Nucleotide-excisieherstel (NER) repareert en verwijdert thyminedimeren in de individuele cel, die vervolgens in de urine worden uitgescheiden. Thymine-dimeren in de urine zijn een biomarker voor totaal DNA-herstel. In het verleden bestond er een methode voor het kwantificeren van thyminedimeren in urine met behulp van isotopenlabeling. De methode was zeer gevoelig maar had een lange analysetijd en daarnaast is het vanuit een werkomgeving een voordeel om niet met radioactieve isotopen te hoeven werken.

   De onderzoekers zijn erin geslaagd een nieuwe analysemethode te ontwikkelen met behulp van UHPLC-MS. Deze methode heeft een hoge gevoeligheid en hoge selectiviteit terwijl het een snelle analysetijd heeft. Bovendien is deze apparatuur in staat om meerdere DNA-modificaties te analyseren. Verder is er een hoge gevoeligheid en hoge selectiviteit. Deze studie is een proof-of-concept studie waarin de onderzoekers willen onderzoeken wanneer de meest optimale tijd voor urineverzameling is na twee verschillende bestralingsregimes. Het perspectief is om de methode te kunnen gebruiken om nieuwe potentiële fotobeschermende en fotocarcinogene stoffen te vinden.

2. Methode

   Studieopzet voor gezonde proefpersonen

   De proefpersonen (n = 16-20) worden gerekruteerd door middel van een bericht op de ziekenhuiswebsite van Bispebjerg. Proefpersonen worden uitgenodigd voor een eerste screeningsbezoek waar deelnemers mondelinge informatie over het onderzoek krijgen van proefleider Catharina Lerche. De bijeenkomst vindt plaats in een aparte ruimte om een ​​veilige en rustige omgeving te garanderen. Proefpersonen zullen worden geïnformeerd dat deelnemers desgewenst een assistent kunnen meebrengen. Er wordt gezorgd voor schriftelijke geïnformeerde toestemming, die ten minste 24 uur na het screeningsbezoek plaatsvindt.

   Op basis hiervan worden proefpersonen verdeeld in 2 groepen van 8-10 personen. Groep 1 wordt 3 keer bestraald met 1 standaard erytheemdosis (SED). 1 SED komt overeen met ca. 10 min zon rond kl. 13 op een goede Deense zomerdag. Groep 2 wordt eenmaal bestraald met 3 SED, wat overeenkomt met ca. 30 minuten rond kl. 13 op een goede Deense zomerdag. De bestraling wordt uitgevoerd op dag 1 voor groep 2 en op dag 1, 2 en 3 voor groep 1.

   Onderwerpen worden bestraald in een full-body UV-cabine (Waldmann, Willing-Schwenningen, Duitsland) met 26 F85 / 100W UV6-buizen (290-350 nm, breedspectrum). De bestralingstijd wordt op een tijdklok ingesteld zodat de UV-cabine na de gewenste bestralingstijd uitschakelt. De bestralingstijd is 16 seconden voor een 1 SED en 43 seconden voor een 3 SED. De UV-cabine wordt gemeten met gekalibreerde apparatuur, waarmee ook UV-cabines in de kliniek worden gemeten, die worden gebruikt voor patiënten. De proefpersonen staan ​​rechtop in de cabine en hebben een scherm op zodat hun ogen en gezicht niet worden blootgesteld aan straling. Bij belichting mogen proefpersonen alleen ondergoed dragen, wat voor mannen een onderbroek/boxershort is, en voor vrouwen beha's en slipjes. Het experiment wordt uitgevoerd tussen oktober en maart, om te voorkomen dat de proefpersonen niet gelijktijdig UV-straling van de zon ontvangen en zo DNA-schade kunnen vormen. Proefpersonen moeten ochtendurine opvangen in gedistribueerde containers en deze tot het laatste bezoek in hun eigen vriezer bewaren.

   Ochtendurine (2x 50 ml) wordt opgevangen vóór de bestraling, dag 1 genoemd en zelfs tot dag 8 na de laatste bestraling, dwz. dag 10 voor groep 1 en dag 8 voor groep 2. 2 x 50 ml x 10 in totaal 1000 ml urine wordt opgevangen voor groep 1 en 2 x 50 ml x 8 in totaal 800 ml urine voor groep 2. Voor en na bij elke belichting worden pigment en roodheid gemeten bij de proefpersonen en bij de laatste bezoeken. Pigment- en roodheidsmetingen worden uitgevoerd op de rug, borst en billen.

3. Statistische overwegingen

   Eerdere studies hebben een toename waargenomen van 1,7 nmol met een verstrooiing (SD) van 1,3 nmol 4, een vermogen van 0,80, evenals een significantieniveau van 0,05 in een gepaarde test, waarna 7 mensen het onderzoek moeten voltooien wanneer de onderzoekers het vermogen op 0,80 en hebben een significantieniveau van 0,05 en gebruik de gepaarde test (Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; versie 3.1.2). Aangezien het onderzoek tot 10 dagen duurt, kunnen uitvallers worden verwacht, en daarom zijn er 8-10 opgenomen in elk van de twee groepen, dwz. in totaal 16-20 gezonde proefpersonen.

4. Risico's, bijwerkingen en nadelen op korte en lange termijn

   Er is een klein risico op roodheid op korte termijn na verlichting, evenals na verblijf in de zon. De UV-doses (3 SED) zijn zo gekozen dat bijna alle Denen roodheid zullen vermijden. De totale UV-dosis komt overeen met een verblijf van een half uur in de zon midden op de dag tijdens de zomer in Denemarken. Alle proefpersonen worden zowel mondeling als schriftelijk geïnformeerd over de risico's en mogelijke bijwerkingen.

   Er komt geen biobank. De urinemonsters worden direct na afname geanalyseerd. Overtollig biologisch materiaal wordt na analyse direct vernietigd.

5. Kwaliteitscontrole

   De Helsinki II-verklaring zal worden gerespecteerd, evenals de normen van goed klinisch onderzoek. Het respect voor de privacy en voor de fysieke en mentale integriteit van patiënten wordt gehandhaafd. Het onderzoek wordt bij het Kenniscentrum Datarapportage Hoofdstedelijk Gewest geregistreerd in het elektronische systeem Pactius.

6. Gegevensbescherming en opslag De algemene verordening gegevensbescherming zal worden gerespecteerd. Onderzoek met gegevens uit de hoofdstedelijke regio wordt beschouwd als publiek onderzoek. Het gebruik en de distributie van gegevens die in dit onderzoek zijn verzameld, zullen tijdens het toestemmingsproces met patiënten worden besproken. Het project wordt in het elektronische systeem Pactius gerapporteerd aan het Kenniscentrum voor Datarapportage, het Hoofdstedelijk Gewest van Denemarken. Er wordt een lijst opgesteld met de namen van de proefpersonen, de studie-ID en de geboortedatum. Alle verzamelde gegevens worden geanonimiseerd en beschermd door de Deense wetgeving met betrekking tot de omgang met persoonsgegevens en de gezondheidswet. Gegevens worden geregistreerd en gedurende 5 jaar na voltooiing van het onderzoek bewaard op de afdeling Dermatologie van het Bispebjerg-ziekenhuis.
7. Economie Het zijn apotheker Catharina Lerche, professor Hans Christian Wulf en ingenieur Peter Philipsen die het initiatief hebben genomen voor het experiment, en de onderzoekers worden allemaal betaald door de huidafdeling van het ziekenhuis van Bispebjerg. Er zijn geen bijdragen van bedrijven of externe fondsen aan dit experiment.
8. Informatie voor proefpersonen De hoofdonderzoeker, Catharina M. Lerche, is verantwoordelijk voor het verstrekken van duidelijke mondelinge en schriftelijke informatie over de doelen, opzet en risico's van het onderzoek, zoals vermeld in "Informatie en toestemming voor deelname aan gezondheidswetenschappelijke onderzoeksprojecten" door de Ministerie van Volksgezondheid en Ouderen. In een ongestoorde omgeving wordt de deelnemer gewezen op zijn recht op aanwezigheid van één/of meerdere begeleiders, dat deelname vrijwillig is en dat terugtrekking op elk moment tijdens het onderzoek mogelijk is. Proefpersonen krijgen voldoende bedenktijd (minimaal 24 uur). Proefpersonen wordt gevraagd een toestemmingsformulier te ondertekenen.
9. Publicatie resultaten Positieve, negatieve en definitieve resultaten zullen worden gepubliceerd. Het doel is om de resultaten te publiceren en te presenteren in een peer-reviewed internationaal dermatologisch tijdschrift en/of op dermatologische conferenties. De intellectuele eigendomsrechten op de resultaten behoren toe aan het Bispebjerg Ziekenhuis. Publicaties zullen voldoen aan de Vancouver Guidelines.
10. Ethiek Persoonsgegevens en urinemonsters worden verwerkt in overeenstemming met de Wet Persoonsgegevens en de Gezondheidswet. Het project wordt ook uitgevoerd met minimale gezondheids- en veiligheidsrisico's voor de deelnemers. De verwachting is dat de potentiële risico's op bijwerkingen in deze studie zeer klein zijn. Het potentieel voor evidence-based toekomstige voordelen en de toekomstperspectieven die deze studie kan bieden, moeten worden afgewogen tegen deelname aan de studie. Deense wetten inzake patiëntenrechten en vergoedingen worden gevolgd.