Kwantyfikacja produktów naprawy DNA w moczu po naświetlaniu skóry promieniowaniem ultrafioletowym

Tytuł Projektu:

Oznaczanie produktów naprawy DNA w moczu po naświetlaniu skóry UV

1. Zamiar

   Definicja problemu

   Uszkodzenia DNA powstają w skórze pod wpływem ekspozycji na słońce. Najczęstsze uszkodzenia DNA nazywane są dimerami tyminy. Wiele z tych urazów jest naprawianych przez „naprawę przez wycinanie nukleotydów” (NER) i wydalanych z moczem. Znaczenie tego mechanizmu naprawy jest widoczne u pacjentów z defektami w ich NER, którzy mają bardzo wysokie ryzyko zachorowania na raka skóry. Badacze chcą mieć możliwość ilościowego określenia ilości dimerów tyminy w moczu po naświetleniu skóry promieniowaniem ultrafioletowym (UV). Wraz z ustanowieniem takiego systemu testowego docelowo będzie można testować potencjalne substancje fotoochronne lub potencjalne substancje fotokancerogenne na podstawie uszkodzeń mierzonych w moczu po znanej dawce UV. Badacze chcieliby zbadać, kiedy następuje największe wydzielanie tego typu uszkodzeń DNA przy użyciu dwóch różnych schematów naświetlania. Wcześniej możliwe było oznaczanie ilościowe dimerów tyminy w moczu za pomocą metody izotopowej, ale ta metoda nie jest już dostępna i pożądane jest unikanie izotopów. Badacze opracowali nową metodę opartą na ultrawysokociśnieniowej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UHPLC-MS).

   Hipoteza

   Badacze postawili hipotezę, że maksymalne wydalanie dimerów tyminy z moczem występuje 1-4 dni po naświetleniu skóry UV.

   Tło

   Promieniowanie ultrafioletowe (UV) powoduje uszkodzenie DNA w skórze, które może ostatecznie doprowadzić do raka skóry. Dimer tyminy to uszkodzenie DNA, które powstaje tylko wtedy, gdy promienie UV uderzają w DNA w komórkach skóry. Naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER) naprawia i usuwa dimery tyminy w poszczególnych komórkach, które są następnie wydalane z moczem. Dimery tyminy w moczu są biomarkerem całkowitej naprawy DNA. W przeszłości istniała metoda oznaczania ilościowego dimerów tyminy w moczu za pomocą znakowania izotopowego. Metoda była bardzo czuła, ale wymagała długiego czasu analizy, a ponadto zaletą środowiska pracy jest unikanie pracy z izotopami promieniotwórczymi.

   Naukowcom udało się opracować nową metodę analizy z wykorzystaniem UHPLC-MS. Metoda ta charakteryzuje się wysoką czułością i wysoką selektywnością przy jednoczesnym krótkim czasie analizy. Ponadto sprzęt ten jest w stanie analizować wiele modyfikacji DNA. Ponadto istnieje wysoka czułość i wysoka selektywność. To badanie jest badaniem potwierdzającym słuszność koncepcji, w którym badacze chcieliby zbadać, kiedy najbardziej optymalny czas na pobranie moczu przypada na dwa różne schematy naświetlania. Perspektywą jest możliwość wykorzystania tej metody do znalezienia nowych potencjalnych substancji fotoochronnych, jak również fotokancerogennych.

2. metoda

   Projekt badania dla osób zdrowych

   Badani (n = 16-20) są rekrutowani przez ogłoszenie na stronie internetowej szpitala Bispebjerg. Uczestnicy zostaną zaproszeni na wstępną wizytę przesiewową, podczas której uczestnicy otrzymają ustne informacje o badaniu od kierownika badania Cathariny Lerche. Spotkanie odbywa się w osobnej sali, aby zapewnić bezpieczną i cichą atmosferę. Badani zostaną poinformowani, że uczestnicy mogą przyprowadzić asystenta, jeśli sobie tego życzą. Zapewniona zostanie pisemna świadoma zgoda, która ma miejsce co najmniej 24 godziny po wizycie przesiewowej.

   Na tej podstawie badani dzielą się na 2 grupy po 8-10 osób. Grupa 1 jest naświetlana 3 razy 1 standardową dawką rumienia (SED). 1 SED odpowiada ok. 10 min słońce wokół kl. 13 w dobry duński letni dzień. Grupa 2 jest naświetlana raz 3 SED, co odpowiada ok. 30 min okolice kl. 13 w dobry duński letni dzień. Naświetlanie przeprowadza się w dniu 1 dla grupy 2 oraz w dniach 1, 2 i 3 dla grupy 1.

   Osobników naświetla się w kabinie UV na całe ciało (Waldmann, Willing-Schwenningen, Niemcy) z 26 lampami F85 / 100W UV6 (290-350 nm, szerokie spektrum). Czas naświetlania jest ustawiany na zegarze czasowym, dzięki czemu kabina UV wyłącza się po żądanym czasie naświetlania. Czas naświetlania wynosi 16 sekund dla 1 SED i 43 sekundy dla 3 SED. Kabina UV jest mierzona za pomocą skalibrowanego sprzętu, który jest również używany do pomiaru kabin UV w klinice, które są używane dla pacjentów. Badani stoją w kabinie i mają włączony ekran, aby ich oczy i twarz nie były narażone na promieniowanie. Podczas oświetlania osoby badane powinny mieć na sobie wyłącznie bieliznę, którą dla mężczyzn są majtki/bokserki, a dla kobiet staniki i majtki. Eksperyment przeprowadza się między październikiem a marcem, aby uniknąć sytuacji, w której badani nie otrzymują jednocześnie promieniowania UV ze słońca, co może spowodować uszkodzenie DNA. Badani muszą zbierać poranny mocz do przygotowanych pojemników i przechowywać go we własnej zamrażarce do czasu ostatniej wizyty.

   Mocz poranny (2x 50 ml) pobiera się przed napromienianiem, zwanym dniem 1, a nawet do dnia 8 po ostatnim naświetlaniu, tj. dzień 10 dla grupy 1 i dzień 8 dla grupy 2. 2 x 50 ml x 10 łącznie 1000 ml moczu pobiera się dla grupy 1 i 2 x 50 ml x 8 łącznie 800 ml moczu dla grupy 2. Przed i po przy każdym oświetleniu mierzony jest pigment i zaczerwienienie u pacjentów, jak również podczas wizyt końcowych. Pomiary pigmentacji i zaczerwienienia wykonywane są na plecach, klatce piersiowej i pośladkach.

3. Względy statystyczne

   W poprzednich badaniach zaobserwowano wzrost o 1,7 nmol przy rozpraszaniu (SD) 1,3 nmol 4, mocy 0,80, a także poziomie istotności 0,05 w teście sparowanym, wtedy 7 osób musi ukończyć badanie, gdy badacze ustawią moc na 0,80 i mieć poziom istotności 0,05 oraz zastosować test w parach (obliczanie mocy i wielkości próbki, PS, Vanderbilt University; wersja 3.1.2). Ponieważ badanie trwa do 10 dni, można spodziewać się rezygnacji, dlatego do każdej z dwóch grup zalicza się 8-10 osób, tj. łącznie 16-20 zdrowych osób.

4. Zagrożenia, skutki uboczne i wady w perspektywie krótko- i długoterminowej

   Istnieje niewielkie ryzyko krótkotrwałego zaczerwienienia po oświetleniu, a także po przebywaniu na słońcu. Dawki UV (3 SED) zostały dobrane tak, aby prawie wszyscy Duńczycy uniknęli zaczerwienienia. Całkowita dawka UV odpowiada półgodzinnemu przebywaniu na słońcu w środku dnia latem w Danii. Wszyscy uczestnicy zostaną poinformowani ustnie i pisemnie o ryzyku i możliwych skutkach ubocznych.

   Nie powstanie żaden biobank. Próbki moczu są analizowane natychmiast po pobraniu. Nadmiar materiału biologicznego jest niszczony natychmiast po analizie.

5. Kontrola jakości

   Respektowana będzie Deklaracja Helsińska II oraz standardy dobrych badań klinicznych. Utrzymuje się poszanowanie prywatności oraz integralności fizycznej i psychicznej pacjentów. Badanie zostanie zarejestrowane w Centrum Wiedzy o Raportowaniu Danych Regionu Stołecznego w elektronicznym systemie Pactius.

6. Ochrona i przechowywanie danych Ogólne rozporządzenie o ochronie danych będzie przestrzegane. Badania wykorzystujące dane z regionu stołecznego są uważane za badania publiczne. Wykorzystanie i dystrybucja danych zebranych w tym badaniu zostaną omówione z pacjentami podczas procesu uzyskiwania zgody. Projekt jest zgłaszany do Centrum Wiedzy ds. Raportowania Danych Regionu Stołecznego Danii w systemie elektronicznym Pactius. Sporządzana jest lista nazwisk osób, identyfikatorów badań i dat urodzenia. Wszystkie zebrane dane zostaną zanonimizowane i chronione przez duńskie przepisy dotyczące przetwarzania danych osobowych i ustawy o zdrowiu. Dane są rejestrowane i przechowywane przez 5 lat po zakończeniu badania w Klinice Dermatologii Szpitala Bispebjerg.
7. Ekonomia To farmaceuta Catharina Lerche, profesor Hans Christian Wulf i inżynier Peter Philipsen przejęli inicjatywę eksperymentu, a wszyscy badacze są opłacani przez oddział skóry szpitala Bispebjerg. W tym eksperymencie nie ma żadnych wkładów firm ani funduszy zewnętrznych.
8. Informacje dla uczestników Główny badacz, Catharina M. Lerche, jest odpowiedzialna za dostarczenie jasnych ustnych i pisemnych informacji o celach, planach i zagrożeniach związanych z badaniem, jak określono w „Informacjach i zgodzie na udział w projektach badawczych w dziedzinie nauk o zdrowiu” przez Ministerstwo Zdrowia i Osób Starszych. W niezakłóconym otoczeniu uczestnik zostanie poinformowany o swoim prawie do obecności jednego/lub więcej opiekunów, o tym, że udział jest dobrowolny i że istnieje możliwość wycofania się z badania w dowolnym momencie. Osobnikom dano wystarczający czas na zastanowienie się (co najmniej 24 godziny). Pacjenci zostaną poproszeni o podpisanie formularza zgody.
9. Publikacja wyników Pozytywne, negatywne i rozstrzygające wyniki zostaną opublikowane. Celem jest opublikowanie i przedstawienie wyników w recenzowanym międzynarodowym czasopiśmie dermatologicznym i/lub na konferencjach dermatologicznych. Prawa własności intelektualnej do wyników należą do szpitala Bispebjerg. Publikacje będą zgodne z Wytycznymi z Vancouver.
10. Etyka Dane osobowe i próbki moczu są przetwarzane zgodnie z ustawą o danych osobowych i ustawą o zdrowiu. Projekt jest również realizowany przy minimalnym ryzyku dla zdrowia i bezpieczeństwa uczestników. Oczekuje się, że potencjalne ryzyko działań niepożądanych w tym badaniu jest bardzo małe. Potencjał przyszłych korzyści opartych na dowodach i przyszłe perspektywy, które może zapewnić to badanie, należy porównać z udziałem w badaniu. Przestrzegane są duńskie przepisy dotyczące praw pacjentów i odszkodowań.