Quantificação de produtos de reparo de DNA na urina após radiação ultravioleta da pele

Título do projeto:

Determinação de produtos de reparo de DNA na urina após irradiação UV da pele

1. Propósito

   Definição de problema

   Danos no DNA são formados na pele pela exposição ao sol. O dano de DNA mais comum é chamado de dímeros de timina. Muitas dessas lesões são reparadas por "reparo por excisão de nucleotídeos" (NER) e excretadas pela urina. A importância desse mecanismo de reparo é vista em pacientes com defeitos em seu NER, que têm um risco muito alto de desenvolver câncer de pele. Os investigadores querem ser capazes de quantificar a quantidade de dímeros de timina na urina após irradiação ultravioleta (UV) da pele. Com o estabelecimento de tal sistema de teste, eventualmente será possível testar potenciais substâncias fotoprotetoras ou potenciais substâncias fotocarcinogênicas com base nos danos medidos na urina após uma dose conhecida de UV. Os pesquisadores gostariam de investigar quando ocorre a maior secreção desse tipo de dano ao DNA usando dois regimes de irradiação diferentes. Anteriormente, era possível quantificar dímeros de timina na urina usando um método de isótopos, mas esse método não está mais disponível e é desejável evitar isótopos. Os pesquisadores desenvolveram um novo método baseado em cromatografia líquida de alta pressão-espectrometria de massa (UHPLC-MS).

   Hipótese

   Os investigadores têm a hipótese de que a excreção máxima de dímeros de timina na urina ocorre 1-4 dias após a irradiação UV da pele.

   Fundo

   A radiação ultravioleta (UV) causa danos no DNA da pele que podem levar ao câncer de pele. O dímero de timina é um dano ao DNA que só é formado quando os raios UV atingem o DNA nas células da pele. O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) repara e remove os dímeros de timina na célula individual, que são então excretados na urina. Os dímeros de timina na urina são um biomarcador para o reparo total do DNA. No passado, existia um método para quantificar dímeros de timina na urina usando marcação de isótopos. O método era muito sensível, mas tinha um longo tempo de análise e, além disso, é uma vantagem do ambiente de trabalho evitar trabalhar com isótopos radioativos.

   Os investigadores conseguiram desenvolver um novo método de análise usando UHPLC-MS. Este método tem alta sensibilidade e alta seletividade, além de ter um tempo de análise rápido. Além disso, esse equipamento é capaz de analisar múltiplas modificações de DNA. Além disso, há alta sensibilidade e alta seletividade. Este estudo é um estudo de prova de conceito no qual os investigadores gostariam de investigar quando o momento ideal para coleta de urina é após dois regimes de irradiação diferentes. A perspectiva é poder usar o método para encontrar novas substâncias potencialmente fotoprotetoras e também fotocarcinogênicas.

2. Método

   Projeto de estudo para indivíduos saudáveis

   Os indivíduos (n = 16-20) são recrutados por um anúncio no site do hospital de Bispebjerg. Os participantes serão convidados para uma visita de triagem inicial, onde os participantes receberão informações orais sobre o estudo pela supervisora ​​do estudo, Catharina Lerche. A reunião ocorre em uma sala separada para garantir um ambiente seguro e tranquilo. Os participantes serão informados de que os participantes podem trazer um assistente, se assim o desejarem. O consentimento informado por escrito será assegurado e ocorre pelo menos 24 horas após a visita de triagem.

   Com base nisso, os sujeitos são divididos em 2 grupos de 8 a 10 pessoas. O grupo 1 é irradiado 3 vezes com 1 dose padrão de eritema (SED). 1 SED corresponde a aprox. 10 min de sol em torno de kl. 13 em um bom dia de verão dinamarquês. O grupo 2 é irradiado uma vez com 3 SED, o que corresponde a aprox. 30 min em torno de kl. 13 em um bom dia de verão dinamarquês. A irradiação é realizada no dia 1 para o grupo 2 e nos dias 1, 2 e 3 para o grupo 1.

   Os indivíduos são irradiados em uma cabine UV de corpo inteiro (Waldmann, Willing-Schwenningen, Alemanha) com 26 tubos UV6 F85 / 100W (290-350 nm, amplo espectro). O tempo de irradiação é definido em um relógio de modo que a cabine UV desligue após o tempo de irradiação desejado. O tempo de irradiação é de 16 segundos para 1 SED e 43 segundos para 3 SED. A cabine UV é medida usando equipamentos calibrados, que também são usados ​​para medir cabines UV na clínica, que são usadas para pacientes. Os sujeitos ficam de pé na cabine e têm uma tela ligada para que seus olhos e rosto não sejam expostos à radiação. Na iluminação, os sujeitos devem usar apenas roupas íntimas, que para os homens são cuecas/cuecas boxer, enquanto para as mulheres são sutiãs e calcinhas. O experimento é realizado entre outubro e março, para evitar que os sujeitos não recebam simultaneamente a radiação ultravioleta do sol e, assim, possam causar danos ao DNA. Os indivíduos devem coletar urina matinal em recipientes dispensados ​​e devem armazená-la em seu próprio freezer até a visita final.

   A urina da manhã (2x 50 ml) é coletada antes da irradiação, denominada dia 1 e até o dia 8 após a última irradiação, ou seja. dia 10 para o grupo 1 e dia 8 para o grupo 2. 2 x 50 ml x 10 no total 1000 ml de urina são coletados para o grupo 1 e 2 x 50 ml x 8 um total de 800 ml de urina para o grupo 2. Antes e depois cada iluminação são medidos pigmento e vermelhidão nos assuntos, bem como nas visitas finais. Medições de pigmento e vermelhidão são realizadas nas costas, peito e nádegas.

3. Considerações estatísticas

   Estudos anteriores observaram um aumento de 1,7 nmol com um espalhamento (SD) de 1,3 nmol 4, poder de 0,80, bem como nível de significância de 0,05 em um teste pareado, então 7 pessoas devem concluir o estudo quando os investigadores definirem o poder para 0,80 e ter um nível de significância de 0,05 e usar o teste pareado (Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; versão 3.1.2). Como o estudo dura até 10 dias, pode-se esperar desistências e, portanto, 8 a 10 são incluídos em cada um dos dois grupos, ou seja. um total de 16-20 indivíduos saudáveis.

4. Riscos, efeitos colaterais e desvantagens a curto e longo prazo

   Existe um pequeno risco de vermelhidão de curto prazo após a iluminação, bem como após a exposição ao sol. As doses de UV (3 SED) foram escolhidas para que quase todos os dinamarqueses evitem vermelhidão. A dose total de UV corresponde a ½ hora de exposição ao sol no meio do dia durante o verão na Dinamarca. Todos os indivíduos serão informados oralmente e por escrito sobre os riscos e possíveis efeitos colaterais.

   Nenhum biobanco será criado. As amostras de urina são analisadas imediatamente após a coleta. O excesso de material biológico é destruído imediatamente após a análise.

5. Controle de qualidade

   A Declaração de Helsinki II será respeitada, assim como os padrões de boa pesquisa clínica. O respeito pela privacidade, bem como pela integridade física e mental dos pacientes é mantido. O estudo será registrado no Centro de Conhecimento para Relatórios de Dados, da Região da Capital, no sistema eletrônico Pactius.

6. Protecção e armazenamento de dados Será respeitado o regulamento geral de protecção de dados. A pesquisa com dados da região da capital é considerada pesquisa pública. O uso e distribuição dos dados coletados neste estudo serão discutidos com os pacientes durante o processo de consentimento. O projeto é reportado ao Knowledge Center for Data Reporting, da Capital Region of Denmark no sistema eletrônico Pactius. Uma lista dos nomes dos participantes, ID do estudo e data de nascimento é preparada. Todos os dados recolhidos serão anonimizados e protegidos pela legislação dinamarquesa relativa ao tratamento de dados pessoais e à Lei da Saúde. Os dados são registrados e armazenados por 5 anos após a conclusão do estudo no Departamento de Dermatologia do Hospital Bispebjerg.
7. Economia Foram a farmacêutica Catharina Lerche, o professor Hans Christian Wulf e o engenheiro Peter Philipsen quem tomou a iniciativa do experimento, e os investigadores são todos pagos pelo departamento de pele do hospital Bispebjerg. Não há contribuições de empresas ou fundos externos para esta experiência.
8. Informações para os participantes A investigadora principal, Catharina M. Lerche, é responsável por fornecer informações orais e escritas claras sobre os objetivos, projetos e riscos do estudo, conforme declarado em "Informações e consentimento para participar de projetos de pesquisa em ciências da saúde" pelo Ministério da Saúde e Idoso. Em ambiente tranquilo, o participante será informado de seu direito de ter um/ou mais acompanhantes presentes, que a participação é voluntária e que é possível desistir a qualquer momento durante o estudo. Os sujeitos recebem tempo de reflexão suficiente (pelo menos 24 horas). Os indivíduos serão convidados a assinar um formulário de consentimento.
9. Publicação dos resultados Resultados positivos, negativos e conclusivos serão publicados. O objetivo é publicar e apresentar os resultados em uma revista internacional de dermatologia revisada por pares e/ou em conferências dermatológicas. Os direitos de propriedade intelectual dos resultados pertencem ao Bispebjerg Hospital. As publicações obedecerão às Diretrizes de Vancouver.
10. Ética Informações pessoais e amostras de urina são processadas de acordo com a Lei de Dados Pessoais e a Lei de Saúde. O projeto também é implementado com riscos mínimos de saúde e segurança para os participantes. Espera-se que os riscos potenciais de efeitos adversos neste estudo sejam muito pequenos. O potencial para ganhos futuros baseados em evidências e as perspectivas futuras que este estudo pode fornecer devem ser ponderados em relação à participação no estudo. As leis dinamarquesas sobre direitos e compensação dos pacientes são seguidas.