Kvantificering af DNA-reparationsprodukter i urinen efter ultraviolet stråling af huden

Projekt titel:

Bestemmelse af DNA-reparationsprodukter i urin efter UV-bestråling af huden

1. Formål

   Problemdefinition

   DNA-skader dannes i huden ved soleksponering. Den mest almindelige DNA-skade kaldes thymin-dimerer. Mange af disse skader repareres ved "Nucleotide excision repair" (NER) og udskilles gennem urinen. Betydningen af ​​denne reparationsmekanisme ses hos patienter med defekter i deres NER, som har en meget høj risiko for at udvikle hudkræft. Efterforskerne ønsker at kunne kvantificere mængden af ​​thymin-dimerer i urinen efter ultraviolet (UV) bestråling af huden. Med etableringen af ​​et sådant testsystem vil det på sigt være muligt at teste potentielle fotobeskyttende stoffer eller potentielle fotokræftfremkaldende stoffer baseret på skader målt i urinen efter en kendt UV-dosis. Efterforskerne vil gerne undersøge, hvornår den højeste sekretion af denne type DNA-skader opstår ved brug af to forskellige bestrålingsregimer. Det har tidligere været muligt at kvantificere thymin-dimerer i urinen ved hjælp af en isotopmetode, men den metode er ikke længere tilgængelig, og det er ønskeligt at undgå isotoper. Efterforskerne har udviklet en ny metode baseret på Ultra High-pressure Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UHPLC-MS).

   Hypotese

   Forskerne har den hypotese, at maksimal udskillelse af thymin-dimerer i urinen sker 1-4 dage efter UV-bestråling af huden.

   Baggrund

   Ultraviolet (UV) stråling forårsager DNA-skader i huden, som i sidste ende kan føre til hudkræft. Thymindimer er en DNA-skade, der kun dannes, når UV-stråler rammer DNA i hudcellerne. Nucleotide excision repair (NER) reparerer og fjerner thymin-dimerer i den enkelte celle, som derefter udskilles i urinen. Thymin-dimerer i urinen er en biomarkør for total DNA-reparation. Tidligere har der eksisteret en metode til at kvantificere thymin-dimerer i urin ved hjælp af isotopmærkning. Metoden var meget følsom men havde lang analysetid og derudover er det en fordel fra et arbejdsmiljø at undgå at arbejde med radioaktive isotoper.

   Det er lykkedes efterforskerne at udvikle en ny analysemetode ved hjælp af UHPLC-MS. Denne metode har høj følsomhed og høj selektivitet, samtidig med at den har en hurtig analysetid. Derudover er dette udstyr i stand til at analysere flere DNA-modifikationer. Ydermere er der høj følsomhed og høj selektivitet. Denne undersøgelse er et proof-of-concept-studie, hvor efterforskerne gerne vil undersøge, hvornår det mest optimale tidspunkt for urinopsamling er efter to forskellige bestrålingsregimer. Perspektivet er at kunne bruge metoden til at finde nye potentielle fotobeskyttende såvel som fotokræftfremkaldende stoffer.

2. Metode

   Studiedesign for raske forsøgspersoner

   Forsøgspersonerne (n = 16-20) rekrutteres ved opslag på Bispebjergs hospitals hjemmeside. Forsøgspersonerne vil blive inviteret til et indledende screeningsbesøg, hvor deltagerne vil modtage mundtlig information om undersøgelsen af ​​forsøgsvejleder Catharina Lerche. Mødet foregår i et separat lokale for at sikre trygge og rolige rammer. Forsøgspersoner vil blive informeret om, at deltagere kan medbringe en assistent, hvis det ønskes. Skriftligt informeret samtykke vil være sikret, og finder sted mindst 24 timer efter screeningsbesøget.

   Ud fra dette opdeles fagene i 2 grupper á 8-10 personer. Gruppe 1 bestråles 3 gange med 1 standard erytemdosis (SED). 1 SED svarer til ca. 10 min sol omkring kl. 13 på en god dansk sommerdag. Gruppe 2 bestråles én gang med 3 SED, hvilket svarer til ca. 30 min omkring kl. 13 på en god dansk sommerdag. Bestrålingen udføres på dag 1 for gruppe 2 og dag 1, 2 og 3 for gruppe 1.

   Emner bestråles i en helkrops UV-kabine (Waldmann, Willing-Schwenningen, Tyskland) med 26 F85 / 100W UV6-rør (290-350 nm, bredspektret). Bestrålingstiden indstilles på et timerur, så UV-kabinen slukker efter den ønskede bestrålingstid. Bestrålingstiden er 16 sekunder for en 1 SED og 43 sekunder for en 3 SED. UV-kabinen måles ved hjælp af kalibreret udstyr, som også bruges til at måle UV-kabiner i klinikken, som bruges til patienter. Forsøgspersonerne står op i kabinen og har en skærm på, så deres øjne og ansigt ikke udsættes for stråling. Ved belysning bør forsøgspersoner kun have undertøj på, som for mænd er underbukser/boksershorts, mens det for kvinder er bh'er og trusser. Forsøget udføres mellem oktober og marts, for at undgå at forsøgspersonerne ikke samtidig får UV-stråling fra solen og dermed kan danne DNA-skader. Forsøgspersonerne skal samle morgenurin i dispenserede beholdere og opbevare den i egen fryser indtil det sidste besøg.

   Morgenurin (2x 50 ml) opsamles før bestråling, kaldet dag 1 og endda indtil dag 8 efter sidste bestråling, dvs. dag 10 for gruppe 1 og dag 8 for gruppe 2. Der opsamles 2 x 50 ml x 10 i alt 1000 ml urin til gruppe 1 og 2 x 50 ml x 8 i alt 800 ml urin til gruppe 2. Før og efter hver belysning måles pigment og rødme på forsøgspersonerne såvel som ved sidste besøg. Pigment- og rødmemålinger udføres på ryg, bryst og balder.

3. Statistiske overvejelser

   Tidligere undersøgelser har observeret en stigning på 1,7 nmol med en spredning (SD) på 1,3 nmol 4, power på 0,80, samt signifikansniveau på 0,05 i en parret test, så skal 7 personer gennemføre undersøgelsen, når efterforskerne indstiller styrken til 0,80 og har et signifikansniveau på 0,05 og brug den parrede test (Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; version 3.1.2). Da undersøgelsen varer op til 10 dage, kan der forventes frafald, og derfor indgår 8-10 i hver af de to grupper, dvs. i alt 16-20 raske forsøgspersoner.

4. Risici, bivirkninger og ulemper på kort og lang sigt

   Der er en lille risiko for kortvarig rødme efter belysning, samt efter ophold i solen. UV-doserne (3 SED) er valgt, så næsten alle danskere undgår rødme. Den samlede UV-dosis svarer til ½ times ophold i solen midt på dagen om sommeren i Danmark. Alle forsøgspersoner vil blive informeret både mundtligt og skriftligt om risici og mulige bivirkninger.

   Der oprettes ingen biobank. Urinprøverne analyseres umiddelbart efter opsamling. Overskydende biologisk materiale destrueres umiddelbart efter analyse.

5. Kvalitetskontrol

   Helsinki II-erklæringen vil blive respekteret såvel som standarderne for god klinisk forskning. Respekten for privatlivets fred samt for fysisk og mental integritet hos patienterne opretholdes. Undersøgelsen vil blive registreret hos Videncenter for Dataindberetning, Region Hovedstaden, i det elektroniske system Pactius.

6. Databeskyttelse og opbevaring Den generelle databeskyttelsesforordning vil blive respekteret. Forskning med data fra hovedstadsregionen betragtes som offentlig forskning. Brugen og distributionen af ​​data indsamlet i denne undersøgelse vil blive diskuteret med patienterne under samtykkeprocessen. Projektet indberettes til Videncenter for Dataindberetning, Region Hovedstaden i det elektroniske system Pactius. Der udarbejdes en liste over forsøgspersonernes navne, studie-id og fødselsdato. Alle indsamlede data vil blive anonymiseret og beskyttet af dansk lovgivning om håndtering af personoplysninger og sundhedsloven. Data registreres og opbevares i 5 år efter afslutning af studiet på Dermatologisk afdeling, Bispebjerg Hospital.
7. Økonomi Det er farmaceut Catharina Lerche, professor Hans Christian Wulf og ingeniør Peter Philipsen, der har taget initiativ til forsøget, og efterforskerne er alle lønnet af hudafdelingen, Bispebjerg hospital. Der er ingen bidrag fra virksomheder eller eksterne fonde til dette forsøg.
8. Information til forsøgspersoner Hovedforskeren, Catharina M. Lerche, er ansvarlig for at give klar mundtlig og skriftlig information om undersøgelsens mål, design og risici, som anført i "Information og samtykke til deltagelse i sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter" af Sundheds- og Ældreministeriet. I uforstyrrede omgivelser vil deltageren blive gjort opmærksom på sin ret til at have en/eller flere ledsagere til stede, at deltagelse er frivillig, og at udmeldelse er mulig til enhver tid under undersøgelsen. Forsøgspersonerne får tilstrækkelig betænkningstid (mindst 24 timer). Forsøgspersoner vil blive bedt om at underskrive en samtykkeerklæring.
9. Offentliggørelse af resultater Positive, negative og afgørende resultater vil blive offentliggjort. Målet er at publicere og præsentere resultaterne i et peer-reviewet internationalt dermatologisk tidsskrift og/eller på dermatologiske konferencer. De immaterielle rettigheder til resultaterne tilhører Bispebjerg Hospital. Publikationer vil overholde Vancouver-retningslinjerne.
10. Etik Personoplysninger og urinprøver behandles i overensstemmelse med persondataloven og sundhedsloven. Projektet gennemføres også med minimale sundheds- og sikkerhedsrisici for deltagerne. Det forventes, at de potentielle risici for bivirkninger i denne undersøgelse er meget små. Potentialet for evidensbaserede fremtidige gevinster og de fremtidige perspektiver, som denne undersøgelse kan give, bør afvejes mod forsøgsdeltagelse. Danske love om patienters rettigheder og erstatning følges.