Cuantificación de productos de reparación de ADN en la orina después de la radiación ultravioleta de la piel

Título del Proyecto:

Determinación de productos de reparación del ADN en la orina después de la irradiación UV de la piel

1. Objetivo

   Definición del problema

   El daño al ADN se forma en la piel por la exposición al sol. El daño de ADN más común se llama dímeros de timina. Muchas de estas lesiones se reparan mediante la "reparación por escisión de nucleótidos" (NER) y se excretan a través de la orina. La importancia de este mecanismo de reparación se ve en pacientes con defectos en su NER, que tienen un riesgo muy alto de desarrollar cáncer de piel. Los investigadores quieren poder cuantificar la cantidad de dímeros de timina en la orina después de la irradiación ultravioleta (UV) de la piel. Con el establecimiento de un sistema de prueba de este tipo, eventualmente será posible probar sustancias fotoprotectoras potenciales o sustancias fotocarcinogénicas potenciales en función del daño medido en la orina después de una dosis conocida de UV. A los investigadores les gustaría investigar cuándo ocurre la mayor secreción de este tipo de daño en el ADN utilizando dos regímenes de irradiación diferentes. Anteriormente ha sido posible cuantificar los dímeros de timina en la orina utilizando un método de isótopos, pero ese método ya no está disponible y es deseable evitar los isótopos. Los investigadores han desarrollado un nuevo método basado en cromatografía líquida de ultra alta presión-espectrometría de masas (UHPLC-MS).

   Hipótesis

   Los investigadores tienen la hipótesis de que la excreción máxima de dímeros de timina en la orina ocurre de 1 a 4 días después de la irradiación UV de la piel.

   Antecedentes

   La radiación ultravioleta (UV) causa daños en el ADN de la piel que eventualmente pueden provocar cáncer de piel. El dímero de timina es un daño en el ADN que solo se forma cuando los rayos UV golpean el ADN en las células de la piel. La reparación por escisión de nucleótidos (NER, por sus siglas en inglés) repara y elimina los dímeros de timina en la célula individual, que luego se excretan en la orina. Los dímeros de timina en la orina son un biomarcador para la reparación total del ADN. En el pasado, existía un método para cuantificar los dímeros de timina en la orina utilizando el marcado con isótopos. El método era muy sensible pero tenía un tiempo de análisis largo y además, es una ventaja desde un entorno de trabajo para evitar trabajar con isótopos radiactivos.

   Los investigadores han logrado desarrollar un nuevo método de análisis utilizando UHPLC-MS. Este método tiene alta sensibilidad y alta selectividad mientras que tiene un tiempo de análisis rápido. Además, este equipo es capaz de analizar múltiples modificaciones del ADN. Además, hay alta sensibilidad y alta selectividad. Este estudio es un estudio de prueba de concepto en el que a los investigadores les gustaría investigar cuándo es el momento más óptimo para la recolección de orina después de dos regímenes de irradiación diferentes. La perspectiva es poder utilizar el método para encontrar nuevas sustancias potencialmente fotoprotectoras y fotocarcinogénicas.

2. Método

   Diseño de estudio para sujetos sanos

   Los sujetos (n = 16-20) son reclutados mediante un aviso en el sitio web del hospital de Bispebjerg. Se invitará a los sujetos a una visita de selección inicial donde los participantes recibirán información oral sobre el estudio por parte de la supervisora ​​del ensayo, Catharina Lerche. La reunión se lleva a cabo en una sala separada para garantizar un entorno seguro y tranquilo. Se informará a los sujetos que los participantes pueden traer un asistente si así lo desean. Se garantizará el consentimiento informado por escrito, y tiene lugar al menos 24 horas después de la visita de selección.

   En base a esto, los sujetos se dividen en 2 grupos de 8-10 personas. El grupo 1 se irradia 3 veces con 1 dosis de eritema estándar (SED). 1 SED corresponde a aprox. 10 min sol alrededor de kl. 13 en un buen día de verano danés. El grupo 2 se irradia una vez con 3 SED, lo que corresponde a aprox. 30 min alrededor de kl. 13 en un buen día de verano danés. La irradiación se lleva a cabo el día 1 para el grupo 2 y los días 1, 2 y 3 para el grupo 1.

   Los sujetos se irradian en una cabina UV de cuerpo completo (Waldmann, Willing-Schwenningen, Alemania) con 26 tubos F85 / 100W UV6 (290-350 nm, amplio espectro). El tiempo de irradiación se ajusta en un reloj temporizador para que la cabina UV se apague después del tiempo de irradiación deseado. El tiempo de irradiación es de 16 segundos para 1 SED y de 43 segundos para 3 SED. La cabina UV se mide con un equipo calibrado, que también se usa para medir las cabinas UV en la clínica, que se usan para los pacientes. Los sujetos se paran en la cabina y tienen una pantalla encendida para que sus ojos y cara no estén expuestos a la radiación. Al iluminar, los sujetos solo deben usar ropa interior, que para los hombres son calzoncillos/calzoncillos bóxer, mientras que para las mujeres son sujetadores y bragas. El experimento se realiza entre octubre y marzo, para evitar que los sujetos no reciban simultáneamente la radiación UV del sol y así puedan formarse daños en el ADN. Los sujetos deben recolectar la orina de la mañana en recipientes dispensados ​​y deben almacenarla en su propio congelador hasta la visita final.

   La orina de la mañana (2x 50 ml) se recolecta antes de la irradiación, llamada día 1 e incluso hasta el día 8 después de la última irradiación, es decir. día 10 para el grupo 1 y día 8 para el grupo 2. Se recogen 2 x 50 ml x 10 en total 1000 ml de orina para el grupo 1 y 2 x 50 ml x 8 en total 800 ml de orina para el grupo 2. Antes y después cada iluminación se miden el pigmento y el enrojecimiento en los sujetos, así como en las visitas finales. Las mediciones de pigmentación y enrojecimiento se realizan en la espalda, el pecho y las nalgas.

3. Consideraciones estadísticas

   Estudios previos han observado un aumento de 1,7 nmol con una dispersión (SD) de 1,3 nmol 4, poder de 0,80, así como un nivel de significancia de 0,05 en una prueba pareada, luego 7 personas deben completar el estudio cuando los investigadores establecen el poder para 0,80 y tienen un nivel de significación de 0,05 y utilizan la prueba pareada (Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; versión 3.1.2). Como el estudio dura hasta 10 días, se pueden esperar abandonos y, por lo tanto, se incluyen de 8 a 10 en cada uno de los dos grupos, es decir. un total de 16-20 sujetos sanos.

4. Riesgos, efectos secundarios y desventajas a corto y largo plazo

   Existe un ligero riesgo de enrojecimiento a corto plazo después de la iluminación, así como después de permanecer bajo el sol. Las dosis de UV (3 SED) se han elegido para que casi todos los daneses eviten las rojeces. La dosis total de UV corresponde a una estancia de ½ hora al sol al mediodía durante el verano en Dinamarca. Todos los sujetos serán informados tanto oralmente como por escrito sobre los riesgos y posibles efectos secundarios.

   No se creará ningún biobanco. Las muestras de orina se analizan inmediatamente después de su recolección. El exceso de material biológico se destruye inmediatamente después del análisis.

5. Control de calidad

   Se respetará la Declaración de Helsinki II y los estándares de buena investigación clínica. Se mantiene el respeto a la privacidad así como a la integridad física y psíquica de los pacientes. El estudio será registrado en el Centro de Conocimiento para Reporte de Datos, Región Capital, en el sistema electrónico Pactius.

6. Protección y almacenamiento de datos Se respetará la normativa general de protección de datos. La investigación que utiliza datos de la región de la capital se considera investigación pública. El uso y la distribución de los datos recopilados en este estudio se analizarán con los pacientes durante el proceso de consentimiento. El proyecto se informa al Centro de conocimiento para el informe de datos, la región capital de Dinamarca en el sistema electrónico Pactius. Se prepara una lista de los nombres de los sujetos, la identificación del estudio y la fecha de nacimiento. Todos los datos recopilados serán anonimizados y protegidos por la legislación danesa sobre el manejo de datos personales y la Ley de Salud. Los datos se registran y almacenan durante 5 años después de la finalización del estudio en el Departamento de Dermatología del Hospital Bispebjerg.
7. Economía La farmacéutica Catharina Lerche, el profesor Hans Christian Wulf y el ingeniero Peter Philipsen han tomado la iniciativa del experimento, y todos los investigadores son pagados por el departamento de piel del hospital de Bispebjerg. No hay aportes de empresas o fondos externos a este experimento.
8. Información para los sujetos La investigadora principal, Catharina M. Lerche, es responsable de brindar información clara, oral y escrita, sobre los objetivos, diseños y riesgos del estudio, tal como se establece en "Información y consentimiento para participar en proyectos de investigación en ciencias de la salud" de la Ministerio de Salud y Adulto Mayor. En un entorno tranquilo, se informará al participante de su derecho a tener uno o más asistentes presentes, que la participación es voluntaria y que es posible retirarse en cualquier momento durante el estudio. Los sujetos tienen suficiente tiempo de reflexión (al menos 24 horas). Se pedirá a los sujetos que firmen un formulario de consentimiento.
9. Publicación de resultados Se publicarán los resultados positivos, negativos y concluyentes. El objetivo es publicar y presentar los resultados en una revista dermatológica internacional revisada por pares y/o en conferencias dermatológicas. Los derechos de propiedad intelectual de los resultados pertenecen al Hospital Bispebjerg. Las publicaciones cumplirán con las Directrices de Vancouver.
10. Ética La información personal y las muestras de orina se procesan de acuerdo con la Ley de datos personales y la Ley de salud. El proyecto también se implementa con riesgos mínimos para la salud y la seguridad de los participantes. Se espera que los riesgos potenciales de efectos adversos en este estudio sean muy pequeños. El potencial de ganancias futuras basadas en la evidencia y las perspectivas futuras que este estudio puede proporcionar deben sopesarse frente a la participación en el ensayo. Se siguen las leyes danesas sobre los derechos de los pacientes y la compensación.