DNA-korjaustuotteiden kvantifiointi virtsassa ihon ultraviolettisäteilyn jälkeen

Projektin nimi:

DNA-korjaustuotteiden määritys virtsasta ihon UV-säteilytyksen jälkeen

1. Tarkoitus

   Ongelman määrittely

   DNA-vauriot muodostuvat ihoon auringonvalon vaikutuksesta. Yleisintä DNA-vauriota kutsutaan tymiinidimeereiksi. Monet näistä vammoista korjataan "Nucleotide Excision Repair" (NER) -toiminnolla ja erittyvät virtsan kautta. Tämän korjausmekanismin merkitys nähdään potilailla, joilla on NER-virheitä ja joilla on erittäin suuri riski sairastua ihosyöpään. Tutkijat haluavat pystyä määrittämään tymiinidimeerien määrän virtsassa ihon ultraviolettisäteilyn (UV) jälkeen. Tällaisen testijärjestelmän perustamisen myötä on lopulta mahdollista testata mahdollisia valolta suojaavia aineita tai mahdollisia valosyöpää aiheuttavia aineita tunnetun UV-annoksen jälkeen virtsasta mitatun vaurion perusteella. Tutkijat haluaisivat selvittää, milloin tämän tyyppisen DNA-vaurion suurin eritys tapahtuu käyttämällä kahta erilaista säteilytysohjelmaa. Tymiinidimeerejä on aiemmin voitu määrittää virtsassa isotooppimenetelmällä, mutta sitä menetelmää ei ole enää saatavilla ja isotooppeja on toivottavaa välttää. Tutkijat ovat kehittäneet uuden menetelmän, joka perustuu ultrakorkeapainenestekromatografia-massaspektrometriaan (UHPLC-MS).

   Hypoteesi

   Tutkijoilla on hypoteesi, että tymiinidimeerien maksimaalinen erittyminen virtsaan tapahtuu 1-4 päivää ihon UV-säteilytyksen jälkeen.

   Tausta

   Ultraviolettisäteily (UV) aiheuttaa ihossa DNA-vaurioita, jotka voivat lopulta johtaa ihosyöpään. Tymiinidimeeri on DNA-vaurio, joka muodostuu vain, kun UV-säteet osuvat DNA:han ihosoluissa. Nukleotidien poistokorjaus (NER) korjaa ja poistaa yksittäisen solun tymiinidimeerejä, jotka sitten erittyvät virtsaan. Virtsassa olevat tymiinidimeerit ovat biomarkkeri DNA:n kokonaiskorjaukselle. Aiemmin on ollut olemassa menetelmä tymiinidimeerien kvantifioimiseksi virtsassa käyttämällä isotooppimerkintää. Menetelmä oli erittäin herkkä, mutta siinä oli pitkä analyysiaika ja lisäksi työympäristön etu on välttää työskentelyä radioaktiivisten isotooppien kanssa.

   Tutkijat ovat onnistuneet kehittämään uuden analyysimenetelmän UHPLC-MS:llä. Tällä menetelmällä on korkea herkkyys ja selektiivisyys, samalla kun analyysiaika on nopea. Lisäksi tämä laite pystyy analysoimaan useita DNA-modifikaatioita. Lisäksi siinä on korkea herkkyys ja korkea selektiivisyys. Tämä tutkimus on proof-of-concept -tutkimus, jossa tutkijat haluavat selvittää, milloin optimaalinen aika virtsan keräämiselle on kahden eri säteilytysohjelman jälkeen. Perspektiivinä on pystyä käyttämään menetelmää uusien mahdollisten valolta suojaavien ja valosyöpää aiheuttavien aineiden löytämiseen.

2. Menetelmä

   Tutkimussuunnittelu terveille koehenkilöille

   Koehenkilöt (n = 16-20) rekrytoidaan Bispebjergin sairaalan verkkosivuilla olevalla ilmoituksella. Koehenkilöt kutsutaan ensimmäiselle seulontakäynnille, jossa osallistujat saavat suullista tietoa tutkimuksesta kokeen ohjaajalta Catharina Lercheltä. Kokous pidetään erillisessä huoneessa turvallisen ja hiljaisen ympäristön varmistamiseksi. Koehenkilöille ilmoitetaan, että osallistujat voivat halutessaan ottaa avustajan mukaan. Kirjallinen tietoinen suostumus varmistetaan, ja se tapahtuu vähintään 24 tuntia seulontakäynnin jälkeen.

   Tämän perusteella aiheet jaetaan kahteen 8-10 hengen ryhmään. Ryhmää 1 säteilytetään 3 kertaa 1 standardi eryteemaannoksella (SED). 1 SED vastaa n. 10 min aurinkoa noin kl. 13 hyvänä tanskalaisena kesäpäivänä. Ryhmää 2 säteilytetään kerran 3 SED:llä, mikä vastaa n. 30 min noin kl. 13 hyvänä tanskalaisena kesäpäivänä. Säteilytys suoritetaan päivänä 1 ryhmälle 2 ja päivinä 1, 2 ja 3 ryhmälle 1.

   Koehenkilöitä säteilytetään koko kehon UV-kaapissa (Waldmann, Willing-Schwenningen, Saksa) 26 F85 / 100W UV6-putkella (290-350 nm, laaja spektri). Säteilytysaika asetetaan ajastinkelloon siten, että UV-kaappi sammuu halutun säteilytysajan jälkeen. Säteilytysaika on 16 sekuntia 1 SED:lle ja 43 sekuntia 3 SED:lle. UV-kaappi mitataan kalibroidulla laitteistolla, jolla mitataan myös klinikan potilaiden käytössä olevia UV-kaappeja. Kohdehenkilöt seisovat matkustamossa ja heillä on näyttö päällä, jotta heidän silmänsä ja kasvonsa eivät altistu säteilylle. Valaistuksessa kohteiden tulee käyttää vain alusvaatteita, jotka miehillä ovat alushousut/bokserit, kun taas naisilla rintaliivit ja pikkuhousut. Kokeilu suoritetaan loka-maaliskuussa, jotta koehenkilöt eivät samanaikaisesti saa auringon UV-säteilyä ja voisi siten muodostaa DNA-vaurioita. Potilaiden on kerättävä aamuvirtsa annosteltuihin astioihin ja säilytettävä se omassa pakastimessaan viimeiseen käyntiin asti.

   Aamuvirtsa (2 x 50 ml) kerätään ennen säteilytystä, jota kutsutaan päiväksi 1 ja jopa päivään 8 viimeisen säteilytyksen jälkeen, eli. päivä 10 ryhmälle 1 ja päivä 8 ryhmälle 2. 2 x 50 ml x 10 yhteensä 1000 ml virtsaa kerätään ryhmälle 1 ja 2 x 50 ml x 8 yhteensä 800 ml virtsaa ryhmälle 2. Ennen ja jälkeen jokainen valaistus mitataan pigmentti ja punoitus kohteista sekä viimeisillä vierailuilla. Pigmentti- ja punoitusmittaukset tehdään selästä, rinnasta ja pakaroista.

3. Tilastolliset näkökohdat

   Aiemmat tutkimukset ovat havainneet 1,7 nmol:n lisäyksen sironnolla (SD) 1,3 nmol 4, teholla 0,80 sekä merkitsevyystasolla 0,05 paritestissä, sitten 7 ihmisen on suoritettava tutkimus, kun tutkijat asettavat tehon 0,80 ja merkitsevyystaso 0,05 ja käytä paritestiä (Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; versio 3.1.2). Koska tutkimus kestää jopa 10 päivää, voidaan odottaa keskeyttäjiä, joten kumpaankin ryhmään sisältyy 8-10, ts. yhteensä 16-20 tervettä henkilöä.

4. Riskit, sivuvaikutukset ja haitat lyhyellä ja pitkällä aikavälillä

   Lyhytaikaisen punoituksen riski on pieni valaistuksen jälkeen sekä auringossa oleskelun jälkeen. UV-annokset (3 SED) on valittu niin, että melkein kaikki tanskalaiset välttävät punoitusta. Kokonais UV-annos vastaa puolen tunnin oleskelua auringossa keskellä päivää Tanskan kesällä. Kaikille koehenkilöille tiedotetaan sekä suullisesti että kirjallisesti riskeistä ja mahdollisista sivuvaikutuksista.

   Biopankkia ei luoda. Virtsanäytteet analysoidaan välittömästi keräämisen jälkeen. Ylimääräinen biologinen materiaali tuhotaan välittömästi analyysin jälkeen.

5. Laadunvalvonta

   Helsinki II -julistusta noudatetaan sekä hyvän kliinisen tutkimuksen standardeja. Potilaiden yksityisyyttä sekä fyysistä ja henkistä koskemattomuutta kunnioitetaan. Tutkimus rekisteröidään Pääkaupunkiseudun Tiedonraportoinnin osaamiskeskuksessa sähköiseen Pactius-järjestelmään.

6. Tietosuoja ja säilytys Yleistä tietosuoja-asetusta noudatetaan. Pääkaupunkiseudun dataa hyödyntävä tutkimus katsotaan julkiseksi tutkimukseksi. Tässä tutkimuksessa kerätyn tiedon käytöstä ja jakelusta keskustellaan potilaiden kanssa suostumusprosessin aikana. Hanke raportoidaan Tanskan pääkaupunkiseudun Data Reporting -tietokeskukselle sähköisessä Pactius-järjestelmässä. Koehenkilöiden nimistä, tutkimustunnuksesta ja syntymäajasta laaditaan luettelo. Kaikki kerätyt tiedot anonymisoidaan ja suojataan henkilötietojen käsittelyä koskevan Tanskan lainsäädännön ja terveyslain mukaisesti. Tiedot rekisteröidään ja säilytetään 5 vuoden ajan tutkimuksen päätyttyä Bispebjergin sairaalan ihotautien osastolla.
7. Talous Farmaseutti Catharina Lerche, professori Hans Christian Wulf ja insinööri Peter Philipsen ovat tehneet aloitteen kokeeseen, ja kaikki tutkijat maksavat Bispebjergin sairaalan ihoosasto. Yritykset tai ulkopuoliset rahastot eivät osallistu tähän kokeiluun.
8. Tietoa koehenkilöille Päätutkija Catharina M. Lerche on vastuussa selkeän suullisen ja kirjallisen tiedon antamisesta tutkimuksen tavoitteista, suunnitelmista ja riskeistä, kuten on todettu kohdassa "Tiedot ja suostumus osallistua terveystieteellisiin tutkimusprojekteihin". Terveys- ja vanhusministeriö. Häiriöttömässä ympäristössä osallistujalle kerrotaan hänen oikeudestaan ​​olla yksi/tai useampi avustaja paikalla, että osallistuminen on vapaaehtoista ja että osallistuminen on mahdollista milloin tahansa tutkimuksen aikana. Koehenkilöille annetaan riittävästi harkinta-aikaa (vähintään 24 tuntia). Tutkittavia pyydetään allekirjoittamaan suostumuslomake.
9. Tulosten julkaiseminen Positiiviset, negatiiviset ja ratkaisevat tulokset julkaistaan. Tavoitteena on julkaista ja esitellä tuloksia kansainvälisessä vertaisarvioidussa dermatologisessa lehdessä ja/tai dermatologisissa konferensseissa. Tulosten immateriaalioikeudet kuuluvat Bispebjergin sairaalalle. Julkaisut ovat Vancouverin ohjeiden mukaisia.
10. Etiikka Henkilötietoja ja virtsanäytteitä käsitellään henkilötietolain ja terveyslain mukaisesti. Hanke toteutetaan myös siten, että osallistujien terveys- ja turvallisuusriskit ovat minimaaliset. On odotettavissa, että mahdolliset haittavaikutusten riskit ovat tässä tutkimuksessa hyvin pienet. Tämän tutkimuksen mahdollisia näyttöön perustuvia hyötyjä ja tulevaisuudennäkymiä tulee punnita kokeeseen osallistumista vastaan. Potilaiden oikeuksia ja korvauksia koskevia Tanskan lakeja noudatetaan.