ATP a P2X3 receptor u chronického kašle

Toto jsou cíle této studie:

1. Určete, zda je ATP přítomen nebo uvolněn v dýchacích cestách pacientů s idiopatickým chronickým kašlem
2. Zjistěte, zda nedošlo ke zvýšení citlivosti na kašel a citlivosti hrtanu na exogenní ATP
3. Zkoumejte účinky exogenního ATP na zánětlivou odpověď v horních a dolních cestách dýchacích.

Měření výsledku

Toto jsou všechna primární měřítka výsledků této studie:

1. Přítomnost ATP v dýchacích cestách pacientů s idiopatickým chronickým kašlem a lokalizace receptorů P2X2/3 v dýchacích cestách
2. Citlivost na kašel a citlivost hrtanu na exogenní ATP
3. Zánětlivá odpověď v horních a dolních dýchacích cestách na exogenní ATP.

Před screeningem bude získán souhlas s návrhem studie. Screening: Účastníci budou prověřováni před zapojením se do studií. Normální nekašlající pacienti budou dotázáni, zda mají v anamnéze kašel a neměli mít chronický kašel po dobu 8 týdnů nebo déle. Účastníci s chronickým kašlem musí splnit definici chronického kašle, který trval déle než 8 týdnů. Tito účastníci budou rekrutováni z kliniky Royal Brompton Hospital Cough. S ohledem na potvrzení způsobilosti použijeme níže uvedená kritéria pro zařazení a vyloučení.

Studie 1 a 2 Účastníci budou v tomto výzkumném projektu celkem 3 měsíce.

Tato studie bude mít dvě části, které nemusí být chronologické v pořadí:

Studium 1. Po náboru se subjekty zúčastní fibrooptické bronchoskopie.

Studie 2: Subjekty se zúčastní studie účinku inhalace nebulizovaného ATP. Subjekty budou studovány ve 2 dnech oddělených alespoň 5 dny. Každý den, po měření plicních funkcí, FeNO a dotazníků pro kašel, bude subjekt inhalovat buď fyziologický roztok, nebo roztok ATP z nebulizéru, poté bude provedena laryngeální hypersenzitivita, kapsaicinový kašel a indukce sputa. Pořadí ATP nebo fyziologického roztoku bude randomizováno a podávání obou bude zaslepeno pacientům a vyšetřovatelům, kteří měří odpověď na výzvu.

Populace subjektů:

Půjde o studii jednoho místa. Vyšetřovatelé přijmou 12 pacientů s chronickým kašlem navštěvující naši kliniku proti kašli v Royal Brompton Hospital a 8 kontrolních zdravých subjektů (věku a pohlaví).

Účastníci jakéhokoli pohlaví s idiopatickým chronickým kašlem budou studováni a měli by mít chronický kašel trvající alespoň 8 týdnů a měli by být sledováni na klinice proti kašli po dobu alespoň 6 měsíců. Tito účastníci podstoupí protokol s diagnostickou cestou, jak doporučují směrnice Evropské respirační společnosti pro léčbu kašle. Účastníci by měli buď identifikovatelnou příčinu svého kašle, u kterých selhala terapie zaměřená na identifikovanou příčinu, nebo by byli klasifikováni jako mající chronický idiopatický kašel, kde nebyla nalezena žádná identifikovatelná příčina.

Kontrolní nekašlající subjekty budou získávány prostřednictvím inzerátu v rámci nemocnice a místních novin.

Výzkum Intervence a postupy Fiberoptická bronchoskopie Bronchoskopie je standardní diagnostický postup a bude ji provádět zkušený lékař výzkumného týmu.

Bronchoskop s optickým vláknem bude před průchodem do průdušnice protažen buď nosními průchody nebo orofaryngem. Preferovanou cestou budou nosní průchody, ale v případě, že to nelze provést přes nosní průchody, použije se orofarynx. Bronchoalveolární laváž (BAL) bude provedena z pravého středního laloku za použití zahřátého 0,9% fyziologického roztoku se 4 po sobě jdoucími alikvoty po 60 ml. Bronchoskopista poté odebere vzorky buněk vystýlající dýchací cesty pomocí kartáčku a kleští, které umožňují získat malé kousky tkáně.

Po zákroku bude účastník přemístěn z procedury do prostoru zotavení, kde bude sledován ošetřujícím personálem. V případě jakékoli bronchokonstrikce bude léčen nebulizovaným salbutamolem a v případě potřeby bude podána kortikosteroidní terapie. Jakmile bude stabilizovaný, nebude již vyžadovat kyslík a nebude ospalý, bude propuštěn po kontrole výzkumnými lékaři. Lékař však může rozhodnout, že budete muset být pod dohledem, dokud nebudete fit k propuštění domů. Každý pacient, kterému bude během procedury podán midazolam, bude požádán, aby ho v ten den doprovodil domů odpovědný dospělý.

Před zákrokem se používá lokální anestetikum a účastníci mohou pociťovat znecitlivění úst nebo hrdla. U některých pacientů, je-li to bezpečné, bude kanylou podán anxiolytikum (midazolam) v malých dávkách. To je obvykle tolerováno bez problémů.

Po proceduře mohou účastníci pociťovat bolest v krku, chraplavý hlas nebo kašel v důsledku podráždění dýchacích cest, ale to se obvykle během několika hodin upraví. Další příznaky mohou zahrnovat zvýšenou produkci sputa, někdy s krevními pruhy na hlenu a přechodnou horečkou, která se může objevit po několika hodinách po zákroku. To se obvykle upraví během několika hodin a lze mu pomoci užíváním paracetamolu. Nemělo by docházet k dlouhotrvajícím následkům.

Vážná rizika jsou vzácná, ale zahrnují pneumotorax (1 z 2000 případů) a významné krvácení. Účastníci budou po proceduře pečlivě sledováni a pokud se objeví nějaká závažná komplikace, bude jim poskytnuta vhodná léčba v nemocnici.

Sběr kondenzátu z vydechovaného dechu (EBC). EBC bude shromažďován tak, že požádáte subjekt, aby normálně dýchal do ručního zařízení pro odběr dechu od Respire Diagnostics, Imperial College, které ochladí vydechovaný dech, aby umožnilo kondenzaci vydechovaného vzduchu. Subjekt bude dýchat 2 doby po 5 minutách, z nichž každá bude oddělena 3-4minutovým odpočinkem, aby bylo možné nasbírat až 500 mikrolitrů (ul) kapaliny. Kapalina bude uložena pro pozdější analýzu.

Odběr krve Žilní krev (30 ccm) bude odebrána ze žíly na předloktí. Tento test způsobuje přechodné nepohodlí, protože se k odběru vzorku krve používá jehla. Vzorek krve bude použit pro měření různých proteinů a pro získání bílých krvinek pro získání některých typů kmenových buněk.

Kontinuální laryngoskopické vyšetření Kontinuální laryngoskopické vyšetření se provádí na základě předchozí metodiky. Průběžné testování laryngoskopie se provádí umístěním fibrooptického nasendoskopu do zadního nosohltanu a jeho zajištěním pomocí speciální pokrývky hlavy. Pro usnadnění průchodu dalekohledem se používá malé množství mazacího želé. Videosnímky laryngeálního vstupu jsou poté nepřetržitě zaznamenávány, zatímco subjekt provádí různé manévry včetně dýchacích pohybů a kašle. Tyto pohyby budou pozorovány a zaznamenávány před a po různých aspektech provokačního protokolu a umožní nám tak vyhodnotit abnormality pohybu hrtanu a například polohu hlasivek. Bude hodnocena velikost a změna velikosti glotické apertury.

Vyvolání kapsaicinu proti kašli Vyvolání kapsaicinu se provádí tak, jak je stanoveno v naší laboratoři.

Leicesterský dotazník proti kašli. To bude použito k posouzení dopadu chronického kašle na kvalitu života pacientů.

Měření frekvence kašle Frekvence kašle bude měřena objektivně monitorem záznamu kašle Hyfe po dobu 48 hodin.

Všichni zapsaní účastníci studie dostanou vyhrazený telefon nebo hodinky se systémem Android s aplikací Hyfe Research, aby mohli sledovat a zaznamenávat jejich zvuky kašle.

Záznam kašle bude zahrnovat 5 vyžádaných kašlání v době zápisu do studie pro kalibraci. Pracovníci studie budou mít možnost na dálku sledovat narůstající kašel u každého účastníka v reálném čase pomocí řídicího panelu Hyfe Research Platform – a podle potřeby tak ověřovat, zda jsou telefony zapnuté a fungují správně.

Po dokončení studie telefony vyzvedne vyškolený pracovník studie a zajistí, aby byla data automaticky nahrána na server Hyfe.

Hodnocení funkce hrtanu dotazníkem K hodnocení dysfunkce hrtanu použijeme dotazník Laryngeal Hypersensitivity Questionnaire.

Indukce sputa Sputum je vyvoláno inhalací aerosolu sterilního 3% fyziologického roztoku a následně zvýšením na 4% a 5% během 3 period po 5 minutách. Vzorky sputa se odebírají do sterilních nádob.

Vyberou se sputové zátky a jedna část se použije k provedení diferenciálního počítání buněk. K provedení diferenciálního počítání buněk se do zátky sputa přidá dithiothreitol a intenzivně se promíchá na třepačce destiček, aby se sputum rozpustilo. Poté se připraví cytospiny a získají se diferenciální počty buněk.

Kromě toho budou některé buňky umístěny do RNA později pro analýzu RNAseq. Supernatant bude uchován pro pozdější test neuroimunitních biomarkerů.

Spirometrická měření Spirometrie (FEV1 a nucená vitální kapacita, FVC) se měří pomocí suchého klínového spirometru (Vitalograph, Buckinghamshire, UK).

Frakční vydechovaný oxid dusnatý (FeNO) Frakční hladina vydechovaného oxidu dusnatého (FeNO) se měří pomocí přenosného monitoru FeNO (NObreath; Bedfont Scientific Ltd, Rochester, UK) při konstantním výdechovém průtoku 0,05 l/s.

Vzorky z bronchoskopie (i) Bronchiální kartáčky: (a) budou získána sklíčka s připojenými buňkami a uchována pro pozdější imunohistochemickou analýzu (b) buňky budou umístěny do RNA později pro pozdější extrakci pro analýzu RNAseq (c) buňky budou umístěny do kultury .

(ii) Bronchiální biopsie: Pro posouzení morfologie se nařežou řezy o velikosti 5 μm a obarví se hematoxylinem a eosinem. Výzkumníci budou měřit rozsah zánětu a remodelace v těchto biopsiích, jak bylo popsáno dříve. Kromě toho budou tyto řezy použity pro řadu imunohistochemických výzkumů pro lokalizaci ATP a dalších souvisejících neuroimunitních biomarkerů zájmu.

(iii) Bronchoalveolární laváž: Buňky z bronchoalveolární laváže budou umístěny do cytospinu pro počítání diferenciálních buněk. Některé z buněk budou uchovávány v RNAlater pro RNAseq. Tekutina supernatantu BAL bude uchovávána pro pozdější stanovení neuroimunitních markerů včetně ATP.