Recettore ATP e P2X3 nella tosse cronica

Questi gli obiettivi di questo studio:

1. Determinare se l'ATP è presente o rilasciato nelle vie aeree dei pazienti con tosse cronica idiopatica
2. Determinare se vi è un aumento della sensibilità della tosse e della sensibilità laringea all'ATP esogeno
3. Esaminare gli effetti dell'ATP esogeno sulla risposta infiammatoria nelle vie aeree superiori e inferiori.

Misure di risultato

Queste sono tutte misure di esito primarie di questo studio:

1. Presenza di ATP nelle vie aeree di pazienti con tosse cronica idiopatica e localizzazione dei recettori P2X2/3 nelle vie aeree
2. Sensibilità della tosse e sensibilità laringea all'ATP esogeno
3. Risposta infiammatoria delle vie aeree superiori e inferiori all'ATP esogeno.

Il consenso alla progettazione dello studio sarà ottenuto prima dello screening. Screening: i partecipanti saranno sottoposti a screening prima dell'impegno negli studi. Ai pazienti normali che non tossiscono verrà chiesto se hanno una storia di tosse e non avrebbero dovuto avere una tosse cronica per 8 settimane o più. Quei partecipanti con tosse cronica devono soddisfare la definizione di tosse cronica che dura da più di 8 settimane. Questi partecipanti saranno reclutati dalla clinica per la tosse del Royal Brompton Hospital. Utilizzeremo i criteri di inclusione ed esclusione indicati di seguito per quanto riguarda la conferma di idoneità.

Studio 1 e 2 I partecipanti parteciperanno a questo progetto di ricerca per un totale di 3 mesi.

Questo studio sarà diviso in due parti che potrebbero non essere in ordine cronologico:

Studio 1. Dopo il reclutamento, i soggetti parteciperanno a una broncoscopia a fibre ottiche.

Studio 2: i soggetti prenderanno parte a uno studio sull'effetto dell'inalazione di ATP nebulizzato. I soggetti saranno studiati in 2 giorni separati da almeno 5 giorni. Ogni giorno, dopo le misurazioni della funzionalità polmonare, FeNO e questionari sulla tosse, il soggetto inalerà una soluzione salina o ATP da un nebulizzatore, a seguito del quale verrà eseguita l'ipersensibilità laringea, il test della tosse con capsaicina e l'induzione dell'espettorato. L'ordine dell'ATP o della sfida salina sarà randomizzato e la somministrazione di entrambi sarà in cieco per i pazienti e gli investigatori che misurano la risposta alla sfida.

Popolazione soggetto:

Questo sarà uno studio in un unico sito. Gli investigatori recluteranno 12 pazienti con tosse cronica che frequentano la nostra clinica per la tosse presso il Royal Brompton Hospital e 8 soggetti sani di controllo (età e sesso abbinati).

I partecipanti di entrambi i sessi con tosse cronica idiopatica saranno studiati e dovrebbero aver avuto una tosse cronica della durata di almeno 8 settimane e dovrebbero essere seguiti nella Cough Clinic per almeno 6 mesi. Questi partecipanti saranno sottoposti a un protocollo con un percorso diagnostico come raccomandato dalle linee guida della European Respiratory Society per la gestione della tosse. I partecipanti avrebbero una causa identificabile per la loro tosse che ha fallito terapie mirate alla causa identificata o classificato come tosse cronica idiopatica dove non è stata trovata alcuna causa identificabile.

I soggetti di controllo non tosse saranno reclutati tramite pubblicità all'interno dell'ospedale e servizi di giornali locali.

Ricerca Interventi e procedure Broncoscopia a fibre ottiche La broncoscopia è una procedura diagnostica standard e sarà intrapresa da un medico esperto del gruppo di ricerca.

Il broncoscopio a fibre ottiche verrà fatto passare attraverso i passaggi nasali o l'orofaringe prima di passare nella trachea. Le fosse nasali saranno la via preferenziale, ma nel caso in cui ciò non possa essere fatto attraverso le fosse nasali, si utilizzerà l'orofaringe. Il lavaggio broncoalveolare (BAL) verrà eseguito dal lobo medio destro utilizzando soluzione salina allo 0,9% riscaldata con 4 aliquote successive di 60 ml. Il broncoscopista preleverà quindi campioni delle cellule che rivestono le vie aeree utilizzando un pennello e una pinza, quest'ultima consentendo di ottenere piccoli pezzi di tessuto.

Dopo la procedura, il partecipante verrà spostato dalla sala procedure all'area di recupero, dove sarà monitorato dal personale infermieristico. In caso di broncocostrizione verrà trattato con salbutamolo nebulizzato e, se necessario, verrà somministrata una terapia con corticosteroidi. Una volta stabilizzato, non necessitando più di ossigeno e non presentando più sonnolenza, verrà dimesso previa valutazione dei medici di ricerca. Il medico può tuttavia stabilire che tu debba essere tenuto sotto osservazione fino a quando non sei pronto per essere dimesso. Ad ogni paziente a cui viene somministrato midazolam durante la procedura verrà chiesto di avere un adulto responsabile che lo accompagni a casa quel giorno.

L'anestetico locale viene utilizzato prima della procedura e i partecipanti possono avvertire una bocca o una gola intorpidita. In alcuni pazienti, se è sicuro farlo, verrà somministrato un farmaco ansiolitico (midazolam) a piccole dosi attraverso la cannula. Questo di solito è tollerato senza problemi.

Dopo la procedura i partecipanti possono avvertire mal di gola, voce rauca o tosse a causa dell'irritazione delle vie respiratorie, ma questo di solito si risolve entro poche ore. Altri sintomi possono includere l'aumento della produzione di espettorato, a volte con striature di sangue del muco e una febbre transitoria che può verificarsi dopo poche ore dalla procedura. Questo di solito si risolve entro poche ore e può essere aiutato prendendo il paracetamolo. Non dovrebbero esserci sequele di lunga durata.

I rischi gravi sono rari ma includono uno pneumotorace (1 caso su 2000) e un sanguinamento significativo. I partecipanti saranno attentamente monitorati seguendo la procedura e, in caso di gravi complicazioni, riceveranno il trattamento appropriato in ospedale.

Raccolta del condensato del respiro espirato (EBC). L'EBC verrà raccolto chiedendo al soggetto di respirare normalmente su un apparato di raccolta del respiro portatile da Respire Diagnostics, Imperial College, che raffredderà il respiro espirato per consentire la condensazione dell'aria espirata. Il soggetto respirerà per 2 periodi di 5 minuti ciascuno separati da un riposo di 3-4 minuti per consentire la raccolta fino a 500 microlitri (uL) di liquido. Il liquido verrà conservato per analisi successive.

Raccolta del campione di sangue Il sangue venoso (30 cc) verrà prelevato da una vena dell'avambraccio. Questo test provoca un disagio transitorio poiché viene utilizzato un ago per ottenere il campione di sangue. Il campione di sangue verrà utilizzato per misurare varie proteine ​​e per ottenere globuli bianchi per ottenere alcuni tipi di cellule staminali.

Esame laringoscopico continuo Il test laringoscopia continuo viene eseguito sulla base della metodologia precedente. Il test di laringoscopia continua viene eseguito posizionando un nasoendoscopio a fibre ottiche nel rinofaringe posteriore e fissandolo con un copricapo specializzato. Viene utilizzata una piccola quantità di gelatina lubrificante per facilitare il passaggio del cannocchiale. Le immagini video dell'ingresso laringeo vengono, successivamente, registrate continuamente mentre un soggetto esegue varie manovre tra cui movimenti respiratori e tosse. Questi movimenti saranno osservati e registrati prima e dopo i vari aspetti del protocollo di provocazione e ci permetteranno così di valutare le anomalie del movimento laringeo e per esempio la posizione delle corde vocali. Verranno valutate le dimensioni e la variazione delle dimensioni dell'apertura glottica.

Sfida alla tosse con capsaicina La sfida alla capsaicina viene eseguita come stabilito nel nostro laboratorio.

Il questionario sulla tosse di Leicester. Questo sarà utilizzato per valutare l'impatto della tosse cronica sulla qualità della vita dei pazienti.

Misurazione della frequenza della tosse La frequenza della tosse sarà misurata oggettivamente con un monitor di registrazione della tosse Hyfe per 48 ore.

A tutti i partecipanti allo studio iscritti verrà fornito un telefono o orologio Android dedicato caricato con l'applicazione Hyfe Research per monitorare e registrare i loro suoni di tosse.

La registrazione della tosse includerà 5 colpi di tosse sollecitati al momento dell'iscrizione allo studio per la calibrazione. Il personale dello studio avrà la possibilità di monitorare da remoto l'accumulo di colpi di tosse per ciascun partecipante in tempo reale con il Dashboard della piattaforma di ricerca Hyfe, verificando così, se necessario, che i telefoni siano accesi e funzionino in modo appropriato.

Al termine dello studio, un membro del personale dello studio qualificato recupererà i telefoni e assicurerà che i dati siano stati caricati automaticamente sul server Hyfe.

Valutazione della funzione laringea mediante questionario Useremo il Laryngeal Hypersensitivity Questionnaire per valutare la disfunzione laringea.

Induzione dell'espettorato L'espettorato viene indotto mediante inalazione di un aerosol di soluzione fisiologica sterile al 3% e successivamente aumentando al 4% e al 5% durante 3 periodi di 5 minuti ciascuno. I campioni di espettorato vengono raccolti in vasi sterili.

I tappi di espettorato vengono selezionati e una parte viene utilizzata per eseguire conte cellulari differenziali. Per eseguire la conta cellulare differenziale, il ditiotreitolo viene aggiunto al tappo dell'espettorato e miscelato vigorosamente su un agitatore per piastre per solubilizzare l'espettorato. Vengono quindi preparate le citospine e si ottengono i conteggi differenziali delle cellule.

Inoltre, alcune delle cellule verranno successivamente poste nell'RNA per l'analisi di RNAseq. Il surnatante sarà conservato per il successivo dosaggio dei biomarcatori neuroimmuni.

Misurazioni spirometriche La spirometria (FEV1 e capacità vitale forzata, FVC) viene misurata utilizzando uno spirometro a cuneo secco (Vitalograph, Buckinghamshire, UK).

Ossido di azoto espirato frazionato (FeNO) Il livello di ossido di azoto espirato (FeNO) frazionato viene misurato utilizzando un monitor FeNO portatile (NObreath; Bedfont Scientific Ltd, Rochester, Regno Unito) a un flusso espiratorio costante di 0,05 L/s.

Campioni dalla broncoscopia (i) Brushing bronchiale: (a) i vetrini con le cellule attaccate saranno ottenuti e conservati per la successiva analisi immunoistochimica (b) le cellule saranno poste nell'RNA successivamente per la successiva estrazione per l'analisi RNAseq (c) le cellule saranno poste in coltura .

(ii) Biopsie bronchiali: sezioni di cinque μm saranno tagliate e colorate con ematossilina ed eosina per valutare la morfologia. Gli investigatori misureranno l'entità dell'infiammazione e del rimodellamento in queste biopsie come descritto in precedenza. Inoltre, queste sezioni saranno utilizzate per una serie di indagini immunoistochimiche per la localizzazione dell'ATP e di altri biomarcatori neuroimmuni associati di interesse.

(iii) Lavaggio broncoalveolare: le cellule di lavaggio broncoalveolare saranno poste in cytospin per il conteggio delle cellule differenziali. Alcune delle cellule saranno mantenute in RNAlater per RNAseq. Il fluido BAL supernatante verrà conservato per il successivo dosaggio dei marcatori neuroimmuni incluso l'ATP.