Vliv suplementace železa a zinku na biologickou dostupnost B-karotenu u zdravých mužů

Studie se řídila dvojitě zaslepeným zkříženým designem se třemi rameny studie oddělenými týdenními vymývacími periodami. Stručně řečeno, účastníci byli požádáni, aby drželi dietu s nízkým obsahem karotenoidů tím, že se po dobu čtyř dnů vyhýbali veškerému oranžovému, žlutému, červenému a zelenému ovoci a zelenině. Následovaly tři dny striktně bezkarotenové diety, která povolovala pouze potraviny ze stanoveného seznamu (doplňková tabulka A2). V každý den studie byl β-karoten podáván ráno po > 10 hodinovém celonočním hladovění (doplňkový obrázek A1). Všichni účastníci perorálně požili v náhodném pořadí jednu dávku 15 mg β-karotenu (BIOVEA) s placebem (prázdná tobolka), 25 mg železa (FeSO4; Woerwag Pharma GmbH & Co. KG, Boeblingen, Německo) nebo 30 mg zinku (ZnSO4; Woerwag Pharma) kapsle. Večer před zkouškou byla poskytnuta standardizovaná večeře a během celého dne intervence byla poskytována standardizovaná jídla (doplňková tabulka A3). První den studie bylo zaznamenáno množství potravy (hmotnost nebo objem) zkonzumované každým účastníkem pro každé jídlo a stejné množství bylo poskytnuto během následujících dvou ramen, aby byla zajištěna podobná spotřeba jídla, zejména tuku. Voda byla k dispozici neomezeně ke konzumaci po celý den. Vzorky krve byly odebírány ze zavedené žilní kanyly a odebírány v 0 hodin přímo před suplementací p-karotenu a poté každou hodinu po dobu 10 hodin.

Pro stanovení plazmatických koncentrací β-karotenu, LDL- a HDL-cholesterolu a triacylglycerolů (TAG) byla krev odebírána do zkumavek obsahujících EDTA (Sarstedt AG & Co, Nuebrecht, Německo) a ihned centrifugována (3000 x g, 10 min, 4 °C). Ze získaných vzorků plazmy byly tři alikvoty skladovány při -80 °C do další analýzy a zbytek byl ultracentrifugován za účelem získání frakce bohaté na triacylglycerol (TRF). Pro analýzy markerů funkce jater a ledvin byly plazma a sérum získány z krve odebrané v časových bodech 0 a 4 hodiny.

TRF byl připraven podle [10]. Stručně, plazma (3,5 ml) byla přenesena do ultracentrifugační zkumavky a opatrně překryta 8 ml 1,3% chloridem sodným a poté ultracentrifugována (Beckman Coulter, Ultracentrifuga OptimaTM L-80 XP) za použití výkyvného rotoru (SW41Ti) při 150 000 x g pro 1 hodinu při 4 °C. Poté byl TRF izolován přenesením horních ~6 ml, které byly poté překryty plynným dusíkem, aby se minimalizovala oxidace a skladovány při -80 °C až do extrakce.

Vzorky plazmy byly náhodně extrahovány a analyzovány pomocí HPLC podle [15]. Stručně, 40 ul plazmy bylo extrahováno směsí ethanol/n-butanol (50:50) obsahující apo-80-karotenal-methyloxim (12 ul/100 ml; Fluka Analytical (Merck Group KGaA), Darmstadt, Německo) jako vnitřní standard. Po odstředění byl čirý supernatant analyzován pomocí HPLC.

TRF byl extrahován a analyzován pomocí HPLC [15]. Pro extrakci bylo ke 3 ml TRF přidáno 100 ul apo-80-karotenal-methyloximu (12 ul/100 ml) a 2 ml ethanolu (pro deproteinaci) a vortexováno po dobu 30 sekund. Roztok byl dvakrát extrahován 2 ml hexanu. Hexanové vrstvy byly odstraněny, spojeny a odpařeny v odstředivém vakuovém koncentrátoru (Christ, RVC 2-25 CD plus) a vysušený vzorek byl znovu rozpuštěn ve 100 ul acetonitrilu a ihned analyzován pomocí HPLC.

Vzorky plazmy i TRF byly analyzovány pomocí Shimadzu HPLC (LC-10AD) vybaveného UV-Vis detektorem (SPD 20A, nastaveným na 450 nm). Karotenoidy byly separovány pomocí kolony ReproSil 80 ODS-2 (3 um, 250 x 4,6 mm; Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Německo) a eluentu v recirkulačním režimu (82 % acetonitril, 15 % 1,4-dioxin a 3 % methanolu (obj./obj.) obsahujícího 100 mM octanu amonného a 10 mM triethylaminu) při průtoku 1,5 ml/min [15]. Standard β-karotenu (≥97,0 % čistota, Sigma-Aldrich) byl použit ke konstrukci standardní křivky.

Plazmatický TAG, HDL- a LDL-cholesterol byly analyzovány klinickou laboratoří (Laborärzte Sindelfingen, Sindelfingen, Německo).