Effekt af jern- og zinktilskud på B-caroten biotilgængelighed hos raske mænd

Undersøgelsen fulgte et dobbeltblindt crossover-design med tre undersøgelsesarme adskilt af en uges udvaskningsperioder. Kort sagt blev deltagerne bedt om at følge en diæt med lavt indhold af carotenoider ved at undgå alle orange, gule, røde og grønne frugter og grøntsager i fire dage. Dette blev efterfulgt af tre dage med en strengt carotenoidfri diæt, som kun tillod fødevarer fra en specificeret liste (Supplerende tabel A2). På hver undersøgelsesdag blev β-caroten indgivet om morgenen efter en >10 timers faste natten over (supplerende figur A1). Alle deltagere indtog oralt, i tilfældig rækkefølge, en enkelt dosis på 15 mg β-caroten (BIOVEA) med enten placebo (tom kapsel), 25 mg jern (FeSO4; Woerwag Pharma GmbH & Co. KG, Boeblingen, Tyskland) eller 30 mg zink (ZnSO4; Woerwag Pharma) kapsel. En standardiseret middag blev leveret om aftenen før forsøget, og standardiserede måltider blev leveret under hele interventionsdagen (Supplerende tabel A3). På den første undersøgelsesdag blev mængden af ​​mad (vægt eller volumen) indtaget af hver deltager til hvert måltid registreret, og de samme mængder tilvejebragt under de følgende to arme for at sikre ens madforbrug, især fedt. Vand var tilgængeligt ubegrænset til forbrug hele dagen. Blodprøver blev udtaget fra en iboende venekanyle og opsamlet 0 timer direkte før β-carotentilskud og derefter hver time i 10 timer.

Til bestemmelse af plasmakoncentrationer af β-caroten, LDL- og HDL-kolesterol og triacylglyceroler (TAG) blev blod opsamlet i rør indeholdende EDTA (Sarstedt AG & Co, Nuebrecht, Tyskland) og straks centrifugeret (3000 × g, 10) min, 4°C). Fra de opnåede plasmaprøver blev tre alikvoter opbevaret ved -80 °C indtil yderligere analyse, og resten ultracentrifugeret for at opnå den triacylglycerolrige fraktion (TRF). Til analyser af lever- og nyrefunktionsmarkører blev plasma og serum opnået fra blodprøver på 0- og 4-timers tidspunkterne.

TRF'en blev fremstillet ifølge [10]. Kort fortalt blev plasma (3,5 mL) overført til et ultracentrifugerør og forsigtigt overlejret med 8 mL 1,3% natriumchlorid og derefter ultracentrifugeret (Beckman Coulter, OptimaTM L-80 XP Ultracentrifuge) under anvendelse af en svingende skovlrotor (SW41Ti) ved 150.000 xg for 1 time ved 4°C. Bagefter blev TRF isoleret ved at overføre de øverste ~6 ml, som derefter blev overlejret med nitrogengas for at minimere oxidation og opbevaret ved -80 °C indtil ekstraktion.

Plasmaprøverne blev tilfældigt ekstraheret og analyseret ved HPLC ifølge [15]. Kort fortalt blev 40 µL plasma ekstraheret med en ethanol/n-butanol-blanding (50:50) indeholdende apo-80-carotenal-methyloxim (12 µL/100 ml; Fluka Analytical (Merck Group KGaA), Darmstadt, Tyskland) som intern standard. Efter centrifugering blev den klare supernatant analyseret ved HPLC.

TRF'en blev ekstraheret og analyseret ved HPLC [15]. Til ekstraktionen blev 100 µl apo-80-carotenal-methyloxim (12 µL/100 mL) og 2 mL ethanol (til deproteinering) tilsat til 3 mL af TRF og vortexet i 30 sek. Opløsningen blev ekstraheret to gange med 2 ml hexan. Hexanlagene blev fjernet, kombineret og inddampet i en centrifugal vakuumkoncentrator (Christ, RVC 2-25 CD plus), og den tørrede prøve blev genopløst i 100 µL acetonitril og straks analyseret ved HPLC.

Både plasma- og TRF-prøverne blev analyseret under anvendelse af en Shimadzu HPLC (LC-10AD) udstyret med en UV-Vis-detektor (SPD 20A, indstillet til 450 nm). Carotenoider blev adskilt under anvendelse af en ReproSil 80 ODS-2-søjle (3 µm, 250 x 4,6 mm; Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Tyskland) og en eluent i recirkulationstilstand (82 % acetonitril, 15 % 1,4-dioxin og 3 % methanol (vol/vol) indeholdende 100 mM ammoniumacetat og 10 mM triethylamin) ved en strømningshastighed på 1,5 mL/min [15]. En β-carotenstandard (≥97,0 % renhed, Sigma-Aldrich) blev brugt til at konstruere en standardkurve.

Plasma TAG, HDL- og LDL-kolesterol blev analyseret af et klinisk laboratorium (Laborärzte Sindelfingen, Sindelfingen, Tyskland).