Влияние добавок железа и цинка на биодоступность B-каротина у здоровых мужчин

Исследование проводилось по двойному слепому перекрестному дизайну с тремя исследовательскими группами, разделенными недельными периодами вымывания. Короче говоря, участников попросили соблюдать диету с низким содержанием каротиноидов, избегая всех оранжевых, желтых, красных и зеленых фруктов и овощей в течение четырех дней. За этим последовали три дня строгой диеты без каротиноидов, в которой разрешались только продукты из определенного списка (дополнительная таблица A2). В каждый день исследования β-каротин вводили утром после > 10-часового ночного голодания (дополнительная фигура A1). Все участники перорально в случайном порядке принимали разовую дозу 15 мг β-каротина (BIOVEA) либо с плацебо (пустая капсула), либо с 25 мг железа (FeSO4; Woerwag Pharma GmbH & Co. KG, Бёблинген, Германия), либо с 30 мг железа. мг цинка (ZnSO4; Woerwag Pharma) в капсулах. Стандартный ужин был предоставлен вечером перед испытанием, и стандартные блюда были предоставлены в течение всего дня вмешательства (дополнительная таблица A3). В первый день исследования записывалось количество пищи (вес или объем), потребляемой каждым участником для каждого приема пищи, и такое же количество предоставлялось в течение следующих двух групп, чтобы обеспечить одинаковое потребление пищи, особенно жира. Вода была доступна без ограничений для потребления в течение дня. Образцы крови брали из постоянной венозной канюли и собирали в 0 часов непосредственно перед добавлением β-каротина, а затем каждый час в течение 10 часов.

Для определения концентрации в плазме β-каротина, холестерина ЛПНП и ЛПВП и триацилглицеролов (ТАГ) кровь собирали в пробирки, содержащие ЭДТА (Sarstedt AG & Co, Нюбрехт, Германия), и немедленно центрифугировали (3000 × g, 10 мин, 4°С). Из полученных образцов плазмы три аликвоты хранили при -80 °C до дальнейшего анализа, а остальные подвергали ультрацентрифугированию для получения фракции, богатой триацилглицерином (TRF). Для анализа маркеров функции печени и почек плазму и сыворотку получали из крови, взятой в 0- и 4-часовые моменты времени.

TRF готовили согласно [10]. Вкратце, плазму (3,5 мл) перенесли в ультрацентрифужную пробирку и осторожно покрыли 8 мл 1,3% хлорида натрия, а затем ультрацентрифугировали (Beckman Coulter, ультрацентрифуга OptimaTM L-80 XP) с использованием бакетного ротора (SW41Ti) при 150 000 g в течение 1 час при 4°С. После этого TRF выделяли путем переноса верхних ~6 мл, которые затем покрывали газообразным азотом, чтобы свести к минимуму окисление, и хранили при -80 °C до экстракции.

Образцы плазмы случайным образом извлекали и анализировали с помощью ВЭЖХ в соответствии с [15]. Вкратце, 40 мкл плазмы экстрагировали смесью этанол/н-бутанол (50:50), содержащей апо-80-каротенал-метилоксим (12 мкл/100 мл; Fluka Analytical (Merck Group KGaA), Дармштадт, Германия) в качестве внутреннего стандарта. После центрифугирования прозрачный супернатант анализировали с помощью ВЭЖХ.

TRF экстрагировали и анализировали с помощью ВЭЖХ [15]. Для экстракции 100 мкл апо-80-каротеналь-метилоксима (12 мкл/100 мл) и 2 мл этанола (для депротеинизации) добавляли к 3 мл TRF и встряхивали в течение 30 секунд. Раствор дважды экстрагировали 2 мл гексана. Гексановые слои удаляли, объединяли и выпаривали в центробежном вакуумном концентраторе (Christ, RVC 2-25 CD plus), а высушенный образец повторно растворяли в 100 мкл ацетонитрила и немедленно анализировали с помощью ВЭЖХ.

Образцы плазмы и TRF анализировали с использованием ВЭЖХ Shimadzu (LC-10AD), оснащенного детектором UV-Vis (SPD 20A, установка на 450 нм). Каротиноиды разделяли на колонке ReproSil 80 ODS-2 (3 мкм, 250 х 4,6 мм; Dr. Maisch GmbH, Аммербух, Германия) и элюенте в режиме рециркуляции (82 % ацетонитрила, 15 % 1,4-диоксина и 3 % метанола (об./об.), содержащего 100 мМ ацетата аммония и 10 мМ триэтиламина) при скорости потока 1,5 мл/мин [15]. Стандарт β-каротина (≥97,0% чистоты, Sigma-Aldrich) использовали для построения стандартной кривой.

ТАГ плазмы, холестерин ЛПВП и ЛПНП анализировали в клинической лаборатории (Laborärzte Sindelfingen, Зиндельфинген, Германия).