Effect van ijzer- en zinksuppletie op de biologische beschikbaarheid van B-caroteen bij gezonde mannen

De studie volgde een dubbelblind cross-overontwerp met drie onderzoeksarmen gescheiden door uitwasperiodes van een week. Kort gezegd werd de deelnemers gevraagd een carotenoïdenarm dieet te volgen door gedurende vier dagen alle oranje, gele, rode en groene groenten en fruit te vermijden. Dit werd gevolgd door drie dagen van een strikt carotenoïdenvrij dieet, waarbij alleen voedsel van een gespecificeerde lijst was toegestaan ​​(aanvullende tabel A2). Op elke studiedag werd β-caroteen 's ochtends toegediend na een nacht vasten van> 10 uur (aanvullend figuur A1). Alle deelnemers namen oraal, in willekeurige volgorde, een enkele dosis van 15 mg β-caroteen (BIOVEA) in met ofwel een placebo (lege capsule), 25 mg ijzer (FeSO4; Woerwag Pharma GmbH & Co. KG, Boeblingen, Duitsland) of 30 mg zink (ZnSO4; Woerwag Pharma) capsule. Op de avond voor de proef werd een gestandaardiseerd diner verzorgd en gedurende de hele interventiedag werden gestandaardiseerde maaltijden verstrekt (aanvullende tabel A3). Op de eerste studiedag werd de hoeveelheid voedsel (gewicht of volume) die door elke deelnemer voor elke maaltijd werd geconsumeerd, geregistreerd en dezelfde hoeveelheden werden verstrekt tijdens de volgende twee armen om een ​​vergelijkbare voedselconsumptie te garanderen, vooral van vet. Water was de hele dag onbeperkt beschikbaar voor consumptie. Bloedmonsters werden afgenomen uit een inwonende veneuze canule en verzameld op 0 uur direct vóór suppletie met β-caroteen en daarna elk uur gedurende 10 uur.

Voor de bepaling van plasmaconcentraties van β-caroteen, LDL- en HDL-cholesterol en triacylglycerolen (TAG) werd bloed verzameld in buisjes met EDTA (Sarstedt AG & Co, Nuebrecht, Duitsland) en onmiddellijk gecentrifugeerd (3000 x g, 10 minuten, 4°C). Van de verkregen plasmamonsters werden drie aliquots bewaard bij -80 °C tot verdere analyse en de rest werd ultragecentrifugeerd om de triacylglycerolrijke fractie (TRF) te verkrijgen. Voor de analyse van lever- en nierfunctiemarkers werden plasma en serum verkregen uit bloedmonsters op de tijdstippen van 0 en 4 uur.

De TRF is opgesteld volgens [10]. In het kort, plasma (3,5 ml) werd overgebracht naar een ultracentrifugebuis en voorzichtig bedekt met 8 ml 1,3% natriumchloride en vervolgens ultragecentrifugeerd (Beckman Coulter, OptimaTM L-80 XP Ultracentrifuge) met behulp van een zwaaiende emmerrotor (SW41Ti) bij 150.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C. Daarna werd de TRF geïsoleerd door de bovenste ~6 ml over te brengen, die vervolgens werd bedekt met stikstofgas om oxidatie te minimaliseren en tot extractie bij -80 °C werd bewaard.

De plasmamonsters werden willekeurig geëxtraheerd en geanalyseerd met HPLC volgens [15]. In het kort werd 40 µl plasma geëxtraheerd met een mengsel van ethanol/n-butanol (50:50) dat apo-80-carotenal-methyloxim (12 µl/100 ml; Fluka Analytical (Merck Group KGaA), Darmstadt, Duitsland) als interne standaard bevatte. Na centrifugatie werd het heldere supernatant geanalyseerd met HPLC.

De TRF werd geëxtraheerd en geanalyseerd met HPLC [15]. Voor de extractie werden 100 µl apo-80-carotenal-methyloxim (12 µl/100 ml) en 2 ml ethanol (voor deproteïnering) toegevoegd aan 3 ml van de TRF en gedurende 30 seconden gevortext. De oplossing werd tweemaal geëxtraheerd met 2 ml hexaan. De hexaanlagen werden verwijderd, samengevoegd en ingedampt in een centrifugale vacuümconcentrator (Christ, RVC 2-25 CD plus) en het gedroogde monster werd opnieuw opgelost in 100 µl acetonitril en onmiddellijk geanalyseerd met HPLC.

Zowel de plasma- als TRF-monsters werden geanalyseerd met behulp van een Shimadzu HPLC (LC-10AD) uitgerust met een UV-Vis-detector (SPD 20A, ingesteld op 450 nm). Carotenoïden werden gescheiden met behulp van een ReproSil 80 ODS-2-kolom (3 µm, 250 x 4,6 mm; Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Duitsland) en een eluens in recirculatiemodus (82% acetonitril, 15% 1,4-dioxine en 3 % methanol (vol/vol) met 100 mM ammoniumacetaat en 10 mM triethylamine) bij een stroomsnelheid van 1,5 ml/min [15]. Een β-caroteenstandaard (≥97,0% zuiverheid, Sigma-Aldrich) werd gebruikt om een ​​standaardkromme te construeren.

Plasma TAG, HDL- en LDL-cholesterol werden geanalyseerd door een klinisch laboratorium (Laborärzte Sindelfingen, Sindelfingen, Duitsland).