Wirkung einer Eisen- und Zinkergänzung auf die Bioverfügbarkeit von B-Carotin bei gesunden Männern

Die Studie folgte einem doppelblinden Crossover-Design mit drei Studienarmen, die durch einwöchige Auswaschphasen getrennt waren. Kurz gesagt, die Teilnehmer wurden gebeten, sich an eine carotinoidearme Ernährung zu halten, indem sie vier Tage lang alle orangefarbenen, gelben, roten und grünen Früchte und Gemüse meiden. Es folgte eine dreitägige streng carotinoidfreie Diät, die nur Lebensmittel aus einer festgelegten Liste erlaubte (Ergänzungstabelle A2). An jedem Studientag wurde β-Carotin morgens nach einer Fastenzeit von > 10 Stunden über Nacht verabreicht (ergänzende Abbildung A1). Alle Teilnehmer nahmen in zufälliger Reihenfolge eine Einzeldosis von 15 mg β-Carotin (BIOVEA) mit entweder einem Placebo (leere Kapsel), 25 mg Eisen (FeSO4; Woerwag Pharma GmbH & Co. KG, Böblingen, Deutschland) oder 30 mg oral ein mg Zink (ZnSO4; Woerwag Pharma) Kapsel. Am Abend vor der Studie wurde ein standardisiertes Abendessen und während des gesamten Interventionstages standardisierte Mahlzeiten bereitgestellt (Ergänzungstabelle A3). Am ersten Studientag wurde die von jedem Teilnehmer für jede Mahlzeit verzehrte Nahrungsmenge (Gewicht oder Volumen) aufgezeichnet und die gleichen Mengen während der folgenden zwei Arme bereitgestellt, um eine ähnliche Nahrungsaufnahme, insbesondere von Fett, sicherzustellen. Wasser stand den ganzen Tag über uneingeschränkt zum Konsum zur Verfügung. Blutproben wurden aus einer Venenverweilkanüle entnommen und bei 0 Stunden direkt vor der β-Carotin-Ergänzung und dann jede Stunde für 10 Stunden gesammelt.

Zur Bestimmung der Plasmakonzentrationen von β-Carotin, LDL- und HDL-Cholesterin und Triacylglycerolen (TAG) wurde Blut in Röhrchen mit EDTA (Sarstedt AG & Co, Nübrecht, Deutschland) gesammelt und sofort zentrifugiert (3000 × g, 10 min, 4 °C). Von den erhaltenen Plasmaproben wurden drei Aliquots bei –80°C bis zur weiteren Analyse gelagert und der Rest ultrazentrifugiert, um die Triacylglycerol-reiche Fraktion (TRF) zu erhalten. Für die Analysen von Leber- und Nierenfunktionsmarkern wurden Plasma und Serum aus Blutproben zu den Zeitpunkten 0 und 4 Stunden gewonnen.

Die TRF wurde nach [10] erstellt. Kurz gesagt wurde Plasma (3,5 ml) in ein Ultrazentrifugenröhrchen überführt und vorsichtig mit 8 ml 1,3 % Natriumchlorid überschichtet und dann unter Verwendung eines Schwingbecherrotors (SW41Ti) bei 150.000 x g ultrazentrifugiert (Beckman Coulter, OptimaTM L-80 XP Ultracentrifuge). 1 Stunde bei 4 °C. Danach wurde das TRF isoliert, indem die oberen ~6 ml übertragen wurden, die dann mit Stickstoffgas überschichtet wurden, um die Oxidation zu minimieren, und bis zur Extraktion bei –80 °C gelagert wurden.

Die Plasmaproben wurden zufällig entnommen und mittels HPLC nach [15] analysiert. Kurz gesagt wurden 40 &mgr;l Plasma mit einer Ethanol/n-Butanol-Mischung (50:50) extrahiert, die Apo-80-Carotinal-Methyloxim (12 &mgr;l/100 ml; Fluka Analytical (Merck Group KGaA), Darmstadt, Deutschland) als internen Standard enthielt. Nach Zentrifugation wurde der klare Überstand durch HPLC analysiert.

Das TRF wurde extrahiert und durch HPLC analysiert [15]. Für die Extraktion wurden 100 &mgr;l Apo-80-Carotinal-Methyloxim (12 &mgr;l/100 ml) und 2 ml Ethanol (zur Deproteinierung) zu 3 ml des TRF gegeben und für 30 Sekunden gevortext. Die Lösung wurde zweimal mit 2 ml Hexan extrahiert. Die Hexanschichten wurden entfernt, kombiniert und in einem Zentrifugalvakuumkonzentrator (Christ, RVC 2-25 CD plus) eingedampft und die getrocknete Probe in 100 &mgr;l Acetonitril wieder aufgelöst und sofort durch HPLC analysiert.

Sowohl die Plasma- als auch die TRF-Proben wurden unter Verwendung einer Shimadzu HPLC (LC-10AD) analysiert, die mit einem UV-Vis-Detektor (SPD 20A, eingestellt auf 450 nm) ausgestattet war. Carotinoide wurden mit einer ReproSil 80 ODS-2-Säule (3 µm, 250 x 4,6 mm; Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Deutschland) und einem Elutionsmittel im Umlaufmodus (82 % Acetonitril, 15 % 1,4-Dioxin und 3 % Methanol (Vol/Vol) mit 100 mM Ammoniumacetat und 10 mM Triethylamin) bei einer Flussrate von 1,5 ml/min [15]. Ein β-Carotin-Standard (≥97,0 % Reinheit, Sigma-Aldrich) wurde verwendet, um eine Standardkurve zu erstellen.

Plasma-TAG, HDL- und LDL-Cholesterin wurden von einem klinischen Labor (Laborärzte Sindelfingen, Sindelfingen, Deutschland) analysiert.