Effekt av jern- og sinktilskudd på B-karoten biotilgjengelighet hos friske menn

Studien fulgte en dobbeltblind crossover-design med tre studiearmer atskilt med en ukes utvaskingsperioder. Kort fortalt ble deltakerne bedt om å følge en diett med lavt innhold av karotenoider ved å unngå all oransje, gul, rød og grønn frukt og grønnsaker i fire dager. Dette ble fulgt av tre dager med en strengt tatt karotenoidfri diett, som bare tillot mat fra en spesifisert liste (tilleggstabell A2). På hver studiedag ble β-karoten administrert om morgenen etter en >10 timers faste over natten (tilleggsfigur A1). Alle deltakerne inntok oralt, i tilfeldig rekkefølge, en enkeltdose på 15 mg β-karoten (BIOVEA) med enten placebo (tom kapsel), 25 mg jern (FeSO4; Woerwag Pharma GmbH & Co. KG, Boeblingen, Tyskland) eller 30 mg sink (ZnSO4; Woerwag Pharma) kapsel. En standardisert middag ble gitt kvelden før forsøket, og standardiserte måltider ble gitt under hele intervensjonsdagen (tilleggstabell A3). På den første studiedagen ble mengden mat (vekt eller volum) konsumert av hver deltaker for hvert måltid registrert og de samme mengdene gitt under de følgende to armene for å sikre likt matinntak, spesielt av fett. Vann var tilgjengelig ubegrenset for forbruk hele dagen. Blodprøver ble tatt fra en inneliggende venekanyle og tatt 0 timer rett før β-karotentilskudd og deretter hver time i 10 timer.

For bestemmelse av plasmakonsentrasjoner av β-karoten, LDL- og HDL-kolesterol og triacylglyceroler (TAG), ble blod samlet i rør som inneholdt EDTA (Sarstedt AG & Co, Nuebrecht, Tyskland) og umiddelbart sentrifugert (3000 × g, 10 min, 4 °C). Fra de oppnådde plasmaprøvene ble tre alikvoter lagret ved -80 °C inntil videre analyse, og resten ultrasentrifugert for å oppnå den triacylglycerolrike fraksjonen (TRF). For analysene av lever- og nyrefunksjonsmarkører ble plasma og serum hentet fra blodprøver ved tidspunktene 0 og 4 timer.

TRF ble utarbeidet i henhold til [10]. Kort fortalt ble plasma (3,5 mL) overført til et ultrasentrifugerør og forsiktig overlagt med 8 mL 1,3 % natriumklorid og deretter ultrasentrifugert (Beckman Coulter, OptimaTM L-80 XP Ultrasentrifuge) ved bruk av en svingende bøtterotor (SW41Ti) ved 150 000 xg for 1 time ved 4 °C. Etterpå ble TRF isolert ved å overføre de øvre ~6 ml, som deretter ble dekket med nitrogengass for å minimere oksidasjon og lagret ved -80 °C til ekstraksjon.

Plasmaprøvene ble tilfeldig ekstrahert og analysert ved HPLC i henhold til [15]. Kort fortalt ble 40 µL plasma ekstrahert med en etanol/n-butanol-blanding (50:50) inneholdende apo-80-karotenal-metyloksim (12 µL/100 ml; Fluka Analytical (Merck Group KGaA), Darmstadt, Tyskland) som intern standard. Etter sentrifugering ble den klare supernatanten analysert ved HPLC.

TRF ble ekstrahert og analysert ved HPLC [15]. For ekstraksjonen ble 100 µl apo-80-karotenal-metyloksim (12 µL/100 mL) og 2 mL etanol (for deproteinering) tilsatt til 3 mL av TRF og vortexet i 30 sek. Løsningen ble ekstrahert to ganger med 2 ml heksan. Heksanlagene ble fjernet, kombinert og fordampet i en sentrifugalvakuumkonsentrator (Christ, RVC 2-25 CD plus) og den tørkede prøven ble oppløst på nytt i 100 µL acetonitril og umiddelbart analysert ved HPLC.

Både plasma- og TRF-prøvene ble analysert ved bruk av en Shimadzu HPLC (LC-10AD) utstyrt med en UV-Vis-detektor (SPD 20A, satt til 450 nm). Karotenoider ble separert ved bruk av en ReproSil 80 ODS-2-kolonne (3 µm, 250 x 4,6 mm; Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Tyskland) og en eluent i resirkuleringsmodus (82 % acetonitril, 15 % 1,4-dioksin og 3 % metanol (vol/vol) inneholdende 100 mM ammoniumacetat og 10 mM trietylamin) ved en strømningshastighet på 1,5 mL/min [15]. En β-karotenstandard (≥97,0 % renhet, Sigma-Aldrich) ble brukt til å konstruere en standardkurve.

Plasma TAG, HDL- og LDL-kolesterol ble analysert av et klinisk laboratorium (Laborärzte Sindelfingen, Sindelfingen, Tyskland).