Wpływ suplementacji żelaza i cynku na biodostępność B-karotenu u zdrowych mężczyzn

W badaniu przeprowadzono podwójnie ślepą próbę krzyżową z trzema ramionami badania oddzielonymi tygodniowymi okresami wymywania. Krótko mówiąc, uczestników poproszono o przestrzeganie diety ubogiej w karotenoidy poprzez unikanie wszystkich pomarańczowych, żółtych, czerwonych i zielonych owoców i warzyw przez cztery dni. Po tym nastąpiły trzy dni diety ściśle wolnej od karotenoidów, która dopuszczała tylko żywność z określonej listy (tabela uzupełniająca A2). Każdego dnia badania β-karoten podawano rano po > 10 godzinach nocnego postu (dodatkowy rysunek A1). Wszyscy uczestnicy przyjęli doustnie, w przypadkowej kolejności, pojedynczą dawkę 15 mg β-karotenu (BIOVEA) z placebo (pusta kapsułka), 25 mg żelaza (FeSO4; Woerwag Pharma GmbH & Co. KG, Boeblingen, Niemcy) lub 30 mg żelaza (FeSO4; Woerwag Pharma GmbH & Co. KG, Boeblingen, Niemcy) mg cynku (ZnSO4; Woerwag Pharma) kapsułka. Standaryzowaną kolację zapewniono wieczorem przed badaniem, a standardowe posiłki zapewniono przez cały dzień interwencji (tabela uzupełniająca A3). Pierwszego dnia badania rejestrowano ilość pożywienia (wagę lub objętość) spożywaną przez każdego uczestnika dla każdego posiłku i taką samą ilość podawano podczas kolejnych dwóch ramion, aby zapewnić podobne spożycie pokarmu, zwłaszcza tłuszczu. Woda była dostępna do spożycia bez ograniczeń przez cały dzień. Próbki krwi pobierano z założonej na stałe kaniuli żylnej i pobierano w godzinie 0 bezpośrednio przed suplementacją β-karotenu, a następnie co godzinę przez 10 godzin.

W celu oznaczenia stężeń β-karotenu, cholesterolu LDL i HDL oraz triacylogliceroli (TAG) w osoczu pobrano krew do probówek zawierających EDTA (Sarstedt AG & Co, Nuebrecht, Niemcy) i natychmiast odwirowano (3000 x g, 10 min, 4°C). Z otrzymanych próbek osocza trzy porcje przechowywano w -80°C do dalszej analizy, a resztę poddano ultrawirowaniu w celu uzyskania frakcji bogatej w triacyloglicerol (TRF). Do analiz markerów funkcji wątroby i nerek, osocze i surowicę uzyskano z krwi pobranej w punktach czasowych 0 i 4 godzin.

TRF przygotowano zgodnie z [10]. Pokrótce, osocze (3,5 ml) przeniesiono do probówki do ultrawirówki i ostrożnie przykryto 8 ml 1,3% chlorku sodu, a następnie poddano ultrawirowaniu (Beckman Coulter, OptimaTM L-80 XP Ultrawirówka) przy użyciu rotora z wychylnym koszem (SW41Ti) przy 150 000 x g przez 1 godzinę w 4°C. Następnie TRF wyizolowano przez przeniesienie górnych ~6 ml, które następnie pokryto gazowym azotem w celu zminimalizowania utleniania i przechowywano w -80°C do ekstrakcji.

Próbki osocza były losowo ekstrahowane i analizowane metodą HPLC zgodnie z [15]. Pokrótce, 40 ul osocza ekstrahowano mieszaniną etanol/n-butanol (50:50) zawierającą apo-80-karotenal-metylooksym (12 ul/100 ml; Fluka Analytical (Merck Group KGaA), Darmstadt, Niemcy) jako wzorzec wewnętrzny. Po odwirowaniu klarowny supernatant analizowano metodą HPLC.

TRF ekstrahowano i analizowano metodą HPLC [15]. W celu ekstrakcji do 3 ml TRF dodano 100 µl apo-80-karotenal-metylooksymu (12 µl/100 ml) i 2 ml etanolu (do odbiałczenia) i worteksowano przez 30 sek. Roztwór ekstrahowano dwukrotnie 2 ml heksanu. Warstwy heksanu usunięto, połączono i odparowano w wirówkowym koncentratorze próżniowym (Christ, RVC 2-25 CD plus) i wysuszoną próbkę ponownie rozpuszczono w 100 ul acetonitrylu i natychmiast poddano analizie metodą HPLC.

Zarówno próbki osocza, jak i TRF analizowano stosując Shimadzu HPLC (LC-10AD) wyposażoną w detektor UV-Vis (SPD 20A, ustawiony na 450 nm). Karotenoidy rozdzielano za pomocą kolumny ReproSil 80 ODS-2 (3 µm, 250 x 4,6 mm; Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Niemcy) i eluentu w trybie recyrkulacji (82% acetonitrylu, 15% 1,4-dioksyny i 3 % metanolu (obj./obj.) zawierającego 100 mM octanu amonu i 10 mM trietyloaminy) przy natężeniu przepływu 1,5 ml/min [15]. Standard β-karotenu (≥97,0% czystość, Sigma-Aldrich) wykorzystano do skonstruowania krzywej standardowej.

TAG w osoczu, cholesterol HDL i LDL analizowano w laboratorium klinicznym (Laborärzte Sindelfingen, Sindelfingen, Niemcy).