Efeito da suplementação de ferro e zinco na biodisponibilidade de B-caroteno em homens saudáveis

O estudo seguiu um desenho cruzado duplo-cego com três braços de estudo separados por períodos de washout de uma semana. Resumindo, os participantes foram orientados a seguir uma dieta pobre em carotenóides, evitando todas as frutas e vegetais laranjas, amarelos, vermelhos e verdes por quatro dias. Isso foi seguido por três dias de uma dieta estritamente isenta de carotenóides, que permitia apenas alimentos de uma lista especificada (Tabela Suplementar A2). Em cada dia de estudo, o β-caroteno foi administrado pela manhã após um jejum noturno > 10 horas (Figura Suplementar A1). Todos os participantes ingeriram oralmente, em ordem aleatória, uma dose única de 15 mg de β-caroteno (BIOVEA) com placebo (cápsula vazia), 25 mg de ferro (FeSO4; Woerwag Pharma GmbH & Co. KG, Boeblingen, Alemanha) ou 30 mg de zinco (ZnSO4; Woerwag Pharma) cápsula. Um jantar padronizado foi fornecido na noite anterior ao ensaio e refeições padronizadas foram fornecidas durante todo o dia da intervenção (Tabela Suplementar A3). No primeiro dia de estudo, a quantidade de comida (peso ou volume) consumida por cada participante para cada refeição foi registrada e as mesmas quantidades fornecidas durante os dois braços seguintes para garantir um consumo alimentar semelhante, especialmente de gordura. A água estava disponível sem restrições para consumo durante todo o dia. Amostras de sangue foram coletadas de uma cânula venosa interna e coletadas 0 horas diretamente antes da suplementação de β-caroteno e depois a cada hora por 10 horas.

Para a determinação das concentrações plasmáticas de β-caroteno, LDL- e HDL-colesterol e triacilgliceróis (TAG), o sangue foi coletado em tubos contendo EDTA (Sarstedt AG & Co, Nuebrecht, Alemanha) e imediatamente centrifugado (3000 × g, 10 min, 4°C). Das amostras de plasma obtidas, três alíquotas foram armazenadas a -80 °C até análise posterior e o restante ultracentrifugado para obtenção da fração rica em triacilglicerol (TRF). Para as análises dos marcadores de função hepática e renal, plasma e soro foram obtidos a partir de amostras de sangue nos tempos 0 e 4 horas.

O TRF foi preparado de acordo com [10]. Resumidamente, o plasma (3,5 mL) foi transferido para um tubo de ultracentrífuga e cuidadosamente coberto com 8 mL de cloreto de sódio a 1,3% e depois ultracentrifugado (Beckman Coulter, OptimaTM L-80 XP Ultracentrifuge) usando um rotor de balde oscilante (SW41Ti) a 150 000 x g para 1 hora a 4 °C. Posteriormente, o TRF foi isolado transferindo os ~6 mL superiores, que foram então cobertos com gás nitrogênio para minimizar a oxidação e armazenados a -80 °C até a extração.

As amostras de plasma foram extraídas aleatoriamente e analisadas por HPLC de acordo com [15]. Resumidamente, 40 µL de plasma foram extraídos com uma mistura de etanol/n-butanol (50:50) contendo apo-80-carotenal-metiloxima (12 µL/100 mL; Fluka Analytical (Merck Group KGaA), Darmstadt, Alemanha) como padrão interno. Após centrifugação, o sobrenadante límpido foi analisado por HPLC.

O TRF foi extraído e analisado por HPLC [15]. Para a extração, 100 µl de apo-80-carotenal-metiloxima (12 µL/100 mL) e 2 mL de etanol (para desproteinização) foram adicionados a 3 mL do TRF e agitados no vórtex por 30 seg. A solução foi extraída duas vezes com 2 mL de hexano. As camadas de hexano foram removidas, combinadas e evaporadas em um concentrador centrífugo a vácuo (Christ, RVC 2-25 CD plus) e a amostra seca redissolvida em 100 µL de acetonitrila e imediatamente analisada por HPLC.

Ambas as amostras de plasma e TRF foram analisadas usando um Shimadzu HPLC (LC-10AD) equipado com um detector UV-Vis (SPD 20A, ajustado em 450 nm). Os carotenóides foram separados usando uma coluna ReproSil 80 ODS-2 (3 µm, 250 x 4,6 mm; Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Alemanha) e um eluente no modo de recirculação (82% de acetonitrila, 15% de 1,4-dioxina e 3 % de metanol (vol/vol) contendo 100 mM de acetato de amônio e 10 mM de trietilamina) a uma taxa de fluxo de 1,5 mL/min [15]. Um padrão de β-caroteno (≥97,0% pureza, Sigma-Aldrich) foi usado para construir uma curva padrão.

Plasma TAG, colesterol HDL e LDL foram analisados ​​por um laboratório clínico (Laborärzte Sindelfingen, Sindelfingen, Alemanha).