Effetto della supplementazione di ferro e zinco sulla biodisponibilità del B-carotene nei maschi sani

Lo studio ha seguito un disegno crossover in doppio cieco con tre bracci di studio separati da periodi di sospensione di una settimana. In breve, ai partecipanti è stato chiesto di seguire una dieta povera di carotenoidi evitando tutta la frutta e la verdura arancione, gialla, rossa e verde per quattro giorni. Questo è stato seguito da tre giorni di una dieta rigorosamente priva di carotenoidi, che consentiva solo alimenti da un elenco specificato (Tabella supplementare A2). In ogni giorno dello studio, il β-carotene è stato somministrato al mattino dopo un digiuno notturno > 10 ore (Figura A1 supplementare). Tutti i partecipanti hanno ingerito per via orale, in ordine casuale, una singola dose di 15 mg di β-carotene (BIOVEA) con un placebo (capsula vuota), 25 mg di ferro (FeSO4; Woerwag Pharma GmbH & Co. KG, Boeblingen, Germania) o 30 mg di zinco (ZnSO4; Woerwag Pharma) capsula. La sera prima della prova è stata fornita una cena standardizzata e durante l'intera giornata di intervento sono stati forniti pasti standardizzati (Tabella Supplementare A3). Il primo giorno di studio è stata registrata la quantità di cibo (peso o volume) consumata da ciascun partecipante per ogni pasto e le stesse quantità fornite durante i due bracci successivi per garantire un consumo di cibo simile, in particolare di grassi. L'acqua era disponibile senza restrizioni per il consumo durante tutto il giorno. I campioni di sangue sono stati prelevati da una cannula venosa a permanenza e raccolti a 0 ore direttamente prima dell'integrazione di β-carotene e poi ogni ora per 10 ore.

Per la determinazione delle concentrazioni plasmatiche di β-carotene, colesterolo LDL e HDL e triacilgliceroli (TAG), il sangue è stato raccolto in provette contenenti EDTA (Sarstedt AG & Co, Nuebrecht, Germania) e immediatamente centrifugato (3000 × g, 10 minimo, 4°C). Dai campioni di plasma ottenuti, tre aliquote sono state conservate a -80°C fino a ulteriori analisi e il resto è stato ultracentrifugato per ottenere la frazione ricca di triacilglicerolo (TRF). Per le analisi dei marcatori di funzionalità epatica e renale, il plasma e il siero sono stati ottenuti dal sangue prelevato a 0 e 4 ore.

Il TRF è stato preparato secondo [10]. In breve, il plasma (3,5 mL) è stato trasferito in una provetta per ultracentrifuga e accuratamente ricoperto con 8 mL di cloruro di sodio all'1,3% e quindi ultracentrifugato (Beckman Coulter, OptimaTM L-80 XP Ultracentrifuge) utilizzando un rotore oscillante (SW41Ti) a 150.000 x g per 1 ora a 4 °C. Successivamente, il TRF è stato isolato trasferendo i ~ 6 mL superiori, che sono stati poi ricoperti con azoto gassoso per ridurre al minimo l'ossidazione e conservati a -80 °C fino all'estrazione.

I campioni di plasma sono stati estratti in modo casuale e analizzati mediante HPLC secondo [15]. In breve, 40 µL di plasma sono stati estratti con una miscela di etanolo/n-butanolo (50:50) contenente apo-80-carotenale-metilossima (12 µL/100 mL; Fluka Analytical (Merck Group KGaA), Darmstadt, Germania) come standard interno. Dopo la centrifugazione, il surnatante limpido è stato analizzato mediante HPLC.

Il TRF è stato estratto e analizzato mediante HPLC [15]. Per l'estrazione, 100 µl di apo-80-carotenale-metilossima (12 µL/100 mL) e 2 mL di etanolo (per la deproteinizzazione) sono stati aggiunti a 3 mL di TRF e vortexati per 30 sec. La soluzione è stata estratta due volte con 2 mL di esano. Gli strati di esano sono stati rimossi, combinati ed evaporati in un concentratore centrifugo sotto vuoto (Christ, RVC 2-25 CD plus) e il campione essiccato è stato ridisciolto in 100 µL di acetonitrile e immediatamente analizzato mediante HPLC.

Entrambi i campioni di plasma e TRF sono stati analizzati utilizzando un Shimadzu HPLC (LC-10AD) dotato di un rivelatore UV-Vis (SPD 20A, impostato a 450 nm). I carotenoidi sono stati separati utilizzando una colonna ReproSil 80 ODS-2 (3 µm, 250 x 4,6 mm; Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Germania) e un eluente in modalità di ricircolo (82% acetonitrile, 15% 1,4-diossina e 3 % di metanolo (vol/vol) contenente 100 mM di acetato di ammonio e 10 mM di trietilammina) a una velocità di flusso di 1,5 mL/min [15]. Uno standard di β-carotene (≥97,0% purezza, Sigma-Aldrich) è stato utilizzato per costruire una curva standard.

Il TAG plasmatico, il colesterolo HDL e LDL sono stati analizzati da un laboratorio clinico (Laborärzte Sindelfingen, Sindelfingen, Germania).