Efecto de la suplementación con hierro y zinc sobre la biodisponibilidad de B-caroteno en hombres sanos

El estudio siguió un diseño cruzado doble ciego con tres brazos de estudio separados por períodos de lavado de una semana. En resumen, se pidió a los participantes que siguieran una dieta baja en carotenoides evitando todas las frutas y verduras de color naranja, amarillo, rojo y verde durante cuatro días. A esto le siguieron tres días de una dieta estrictamente libre de carotenoides, que solo permitía alimentos de una lista específica (Tabla complementaria A2). En cada día de estudio, se administró β-caroteno por la mañana después de un ayuno nocturno de más de 10 horas (Figura complementaria A1). Todos los participantes ingirieron por vía oral, en orden aleatorio, una dosis única de 15 mg de β-caroteno (BIOVEA) con un placebo (cápsula vacía), 25 mg de hierro (FeSO4; Woerwag Pharma GmbH & Co. KG, Boeblingen, Alemania) o 30 mg de zinc (ZnSO4; Woerwag Pharma) cápsula. Se proporcionó una cena estandarizada la noche anterior al ensayo y se proporcionaron comidas estandarizadas durante todo el día de la intervención (Tabla complementaria A3). En el primer día de estudio, se registró la cantidad de alimentos (peso o volumen) consumidos por cada participante en cada comida y se proporcionaron las mismas cantidades durante los dos brazos siguientes para garantizar un consumo similar de alimentos, especialmente de grasas. El agua estaba disponible sin restricciones para el consumo durante todo el día. Se extrajeron muestras de sangre de una cánula venosa permanente y se recolectaron a las 0 horas directamente antes de la suplementación con β-caroteno y luego cada hora durante 10 horas.

Para la determinación de las concentraciones plasmáticas de β-caroteno, colesterol LDL y HDL y triacilgliceroles (TAG), se recogió sangre en tubos que contenían EDTA (Sarstedt AG & Co, Nuebrecht, Alemania) y se centrifugó inmediatamente (3000 × g, 10 mín., 4 °C). De las muestras de plasma obtenidas, tres alícuotas se almacenaron a -80 °C hasta su posterior análisis y el resto se ultracentrifugó para obtener la fracción rica en triacilglicerol (TRF). Para los análisis de los marcadores de función hepática y renal, se obtuvo plasma y suero de muestras de sangre en los puntos temporales de 0 y 4 horas.

El TRF se preparó de acuerdo con [10]. Brevemente, el plasma (3,5 mL) se transfirió a un tubo de ultracentrífuga y se cubrió cuidadosamente con 8 mL de cloruro de sodio al 1,3 % y luego se ultracentrifugó (Beckman Coulter, Ultracentrífuga OptimaTM L-80 XP) usando un rotor de cubeta oscilante (SW41Ti) a 150 000 x g durante 1 hora a 4 °C. Posteriormente, el TRF se aisló transfiriendo los ~6 ml superiores, que luego se cubrieron con gas nitrógeno para minimizar la oxidación y se almacenaron a -80 °C hasta la extracción.

Las muestras de plasma se extrajeron aleatoriamente y se analizaron por HPLC según [15]. Brevemente, se extrajeron 40 µl de plasma con una mezcla de etanol/n-butanol (50:50) que contenía apo-80-carotenal-metiloxima (12 µl/100 ml; Fluka Analytical (Merck Group KGaA), Darmstadt, Alemania) como estándar interno. Después de la centrifugación, el sobrenadante claro se analizó por HPLC.

El TRF fue extraído y analizado por HPLC [15]. Para la extracción, se añadieron 100 µl de apo-80-carotenal-metiloxima (12 µL/100 mL) y 2 mL de etanol (para desproteinación) a 3 mL de TRF y se agitaron durante 30 segundos. La solución se extrajo dos veces con 2 ml de hexano. Las capas de hexano se eliminaron, combinaron y evaporaron en un concentrador de vacío centrífugo (Christ, RVC 2-25 CD plus) y la muestra seca se volvió a disolver en 100 µl de acetonitrilo y se analizó inmediatamente por HPLC.

Tanto las muestras de plasma como las de TRF se analizaron utilizando un HPLC Shimadzu (LC-10AD) equipado con un detector UV-Vis (SPD 20A, ajustado a 450 nm). Los carotenoides se separaron utilizando una columna ReproSil 80 ODS-2 (3 µm, 250 x 4,6 mm; Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Alemania) y un eluyente en modo de recirculación (82% acetonitrilo, 15% 1,4-dioxina y 3 % de metanol (vol/vol) que contiene acetato de amonio 100 mM y trietilamina 10 mM) a un caudal de 1,5 ml/min [15]. Un estándar de β-caroteno (≥97,0% pureza, Sigma-Aldrich) para construir una curva estándar.

Un laboratorio clínico (Laborärzte Sindelfingen, Sindelfingen, Alemania) analizó TAG plasmático, colesterol HDL y LDL.