Biochemické profilování pacientů s migrénou (SPHERA_WP1_1)

Předchozí důkazy ukázaly, že endokanabidiomový systém (eCBome) je u pacientů s migrénou změněn, což ukazuje: i) změněnou genovou expresi katabolizujících enzymů (MAGL a FAAH) u pacientů s epizodickou a chronickou migrénou ve srovnání se zdravými kontrolami; ii) změněné periferní hladiny endokanabinoidního lipidu palmitoylethanolamidu (PEA) se známkami zvýšených hladin PEA během akutní fáze migrény.

Navzdory vysoké účinnosti a snášenlivosti monoklonálních protilátek mAb namířených proti peptidu souvisejícímu s genem kalcitoninu (mAb), důkazy z RCT a studií v reálném životě ukazují, že mAb selhávají u 40 % pacientů. Tito pacienti mohou nést fenotyp nezávislý na CGRP, potenciálně spojený s dysfunkcí eCBome.

Primárním cílem je provést hloubkovou fenotypizaci celé kohorty pacientů s migrénou porovnáním podskupin pacientů, kteří budou reagovat na léčbu mAb (zejména těch pacientů, kteří dosáhli snížení počtu dnů migrény za měsíc >/= 50 %) ve srovnání s ne - Skupina respondentů (zejména ti pacienti, kteří dosáhli snížení počtu dnů migrény za měsíc < 50 %).

Budeme hodnotit neuropeptidy, mikroRNA, zánětlivé cytokiny a metabolity kynureninu. Tato zjištění umožní identifikaci multibiomarkerového panelu podpisu pacientů s migrénou, kteří odolávají specificky cílené preventivní léčbě a potenciálně odhalují další molekulární cíle.

DESIGN STUDIE:

Tato studie je součástí projektu SPHERA financovaného italským ministerstvem zdravotnictví (GR-2021-12372429). Budou zařazováni pacienti z řad těch, kteří navštěvují ambulanci IRCCS Mondino Institute (Pavia) a neurologické oddělení Univerzity v L'Aquile (Avezzano).

Budeme shromažďovat data před zahájením mAb (výchozí hodnota-TO) a po třech měsících (T1) léčby mAb. Identifikujeme skupiny Repsonder a Non-Repsonder a poté provedeme biochemické profilování dvou podskupin v T0 a T1.

METODY:

Všichni pacienti podstoupí biochemické profilování, které bude zahrnovat analýzu:

• Systém eCBome: hladiny mRNS FAAH, MAGL, DAGL, NAPE, NAAA v mononukleárních buňkách periferní krve,
• plazmatické hladiny AEA, 2-AG, PEA a OEA; CGRP, PACAP a VIP; IL-lbeta, TNF-alfa, IL-4 a IL-10; kyseliny kynurenové a chinolinové;
• miR-382-5p, miR-34a, miR-30a a miR-155 v mononukleárních buňkách periferní krve,
• brokovnicová analýza mikrobioty ve stolici pacientů.

Biochemické vzorky odebíráme mezi 9. a 11. hodinou, abychom se vyhnuli ovlivnění cirkadiánního rytmu. Všechna hodnocení budou provedena v interiktální fázi migrény.

Budou přijaty následující metody sběru:

• Analýza mRNA a mikroRNA v PBMC. Vzorky krve budou odebírány do zkumavek s kyselinou ethylendiamintetraoctovou, nejprve izolujeme PBMC a celkovou RNA. Ubiquitin C a U6 budou fungovat jako provozní geny pro geny kódující enzymy eCBome a miRNA.
• kyselina kynurenová a kyselina chinolinová, AEA, PEA, 2-AG a OEA budou stanoveny podle metody publikované Gao (Gao, 2020). Hladiny metabolitu kinureninu budou měřeny podle metody popsané Fuertigem (Fuertig, 2016).
• Hladiny CGRP alfa, PACAP-38 a VIP budou měřeny pomocí komerčního enzymového imunosorbentního testu
• Cytokiny IL-lbeta, TNF-alfa, IL-4, IL-10 budou měřeny systémem Ella Automated Immunoassay System s panelem testu Simple Plex.
• Analýza mikrobiomu: po správném odběru a uchování vzorků stolice budou dodány do Translační neurovaskulární výzkumné jednotky (IRCCS Mondino Foundation) k extrakci DNA.

STATISTICKÁ ANALÝZA Výpočet velikosti vzorku je definován pro primární výsledek (výraz MAGL), zatímco analýza síly se provádí pro koprimární výsledek (výraz FAAH).

Podle předběžných údajů z práce Greco 2021 naznačujících poměr mezi nereagujícími a reagujícími: 2:3 a expresí genu MAGL: 8±10 RQ u nereagujících a 3±4 RQ u respondentů je minimální velikost vzorku 88 pacientů s migrénou (53 respondentů a 35 nereagujících), aby byl interval spolehlivosti 95 % a síla 80 %.

Pro vyhodnocení parametrických nebo neparametrických metod bude provedena analýza normality.

Provedeme jednorozměrnou analýzu pro hledání rozdílů v demografických, klinických a biochemických parametrech mezi skupinami nereagujícími a reagujícími v T0. Hlavní statistická analýza bude zahrnovat vícerozměrný přístup ke kontrole zmatků. Hladina významnosti bude nastavena na alfa = 0,05 s ohledem na případnou korekci pro vícenásobná srovnání.