Profilazione biochimica dei pazienti con emicrania (SPHERA_WP1_1)

Prove precedenti hanno mostrato che il sistema endocannabidioma (eCBome) è alterato nei pazienti con emicrania dimostrando: i) espressione genica alterata degli enzimi catabolizzanti (MAGL e FAAH) in pazienti con emicrania episodica e cronica rispetto ai controlli sani; ii) livelli periferici alterati del lipido palmitoiletanolamide (PEA) simile agli endocannabinoidi con evidenza di un aumento dei livelli di PEA durante la fase acuta dell'emicrania.

Nonostante l’elevata efficacia e tollerabilità degli anticorpi monoclonali mAbs diretti contro il peptide correlato al gene della calcitonina (mAbs), le prove provenienti da studi randomizzati e studi reali dimostrano che i mAbs falliscono nel 40% dei pazienti. Questi pazienti possono presentare un fenotipo non dipendente dal CGRP, potenzialmente collegato alla disfunzione di eCBome.

Lo scopo primario è quello di eseguire una fenotipizzazione approfondita dell'intera coorte di pazienti con emicrania confrontando i sottogruppi di quei pazienti che saranno Responder al trattamento con mAbs (vale a dire quei pazienti che hanno ottenuto una riduzione dei giorni mensili di emicrania >/= 50%) rispetto ai Non -Gruppo Respoder (ovvero quei pazienti che hanno ottenuto una riduzione dei giorni mensili di emicrania < 50%).

Valuteremo neuropeptidi, microRNA, citochine infiammatorie e metaboliti della chinurenina. Questi risultati consentiranno l'identificazione di un pannello multibiomarcatori di pazienti con emicrania che resistono a trattamenti preventivi specificamente mirati e di svelare potenzialmente altri bersagli molecolari.

PROGETTAZIONE DELLO STUDIO:

Questo studio fa parte del progetto SPHERA con il finanziamento del Ministero della Salute italiano (GR-2021-12372429). I pazienti saranno arruolati tra quelli frequentanti l'ambulatorio dell'IRCCS Istituto Mondino (Pavia) e il Dipartimento di Neurologia dell'Università degli Studi dell'Aquila (Avezzano).

Raccoglieremo i dati prima dell'inizio dei mAbs (baseline-T0) e dopo tre mesi (T1) di trattamento con mAbs. Identificheremo i gruppi Repsonder e Non-responder ed eseguiremo quindi il profilo biochimico dei due sottogruppi a T0 e T1.

METODI:

Tutti i pazienti saranno sottoposti a un profilo biochimico che includerà l'analisi di:

• Sistema eCBome: livelli mRNS di FAAH, MAGL, DAGL, NAPE, NAAA nelle cellule mononucleate del sangue periferico,
• livelli plasmatici di AEA, 2-AG, PEA e OEA; CGRP, PACAP e VIP; IL-1beta, TNF-alfa, IL-4 e IL-10; acidi chinurenico e chinolinico;
• miR-382-5p, miR-34a, miR-30a e miR-155 nelle cellule mononucleari del sangue periferico,
• analisi shotgun del microbiota nelle feci dei pazienti.

Raccoglieremo campioni biochimici tra le 9 e le 11 per evitare l'influenza del ritmo circadiano. Tutta la valutazione verrà eseguita nella fase interictale dell'emicrania.

Verranno adottate le seguenti modalità di raccolta:

• Analisi di mRNA e microRNA nelle PBMC. I campioni di sangue verranno raccolti all'interno di provette di acido etilendiammina tetra-acetico, isoleremo prima le PBMC e l'RNA totale. Ubiquitina C e U6 fungeranno da geni housekeeping per i geni che codificano per gli enzimi eCBome e i miRNA.
• l'acido chinurenico e l'acido chinolinico, AEA, PEA, 2-AG e OEA saranno determinati secondo il metodo pubblicato da Gao (Gao, 2020). I livelli del metabolita della chinurenina saranno misurati secondo il metodo descritto da Fuertig (Fuertig, 2016).
• I livelli di CGRP alfa, PACAP-38 e VIP saranno misurati utilizzando un test immunoassorbente legato a un enzima commerciale
• Le citochine IL-1beta, TNF-alfa, IL-4 e IL-10 saranno misurate dal sistema di dosaggio immunologico automatizzato Ella con un pannello di test Simple Plex.
• Analisi del microbioma: dopo la corretta raccolta e conservazione dei campioni di feci, questi verranno consegnati all'Unità di Ricerca Neurovascolare Traslazionale (IRCCS Fondazione Mondino) per l'estrazione del DNA.

ANALISI STATISTICA Il calcolo della dimensione del campione è definito per l'esito primario (espressione MAGL), mentre viene eseguita un'analisi di potenza per l'esito co-primario (espressione FAAH).

Secondo i dati preliminari del lavoro di Greco 2021 che suggeriscono un rapporto tra Non-responder e Responder: 2:3 ed espressione del gene MAGL: 8±10 RQ nei Non-responder e 3±4 RQ nei Responder, la dimensione minima del campione è di 88 pazienti con emicrania (53 Responder e 35 NON Responder) in modo da avere un intervallo di confidenza del 95% e una potenza dell'80%.

Verrà effettuata un'analisi di normalità per valutare metodi parametrici e non parametrici.

Effettueremo un'analisi univariata per cercare differenze nei parametri demografici, clinici e biochimici tra i gruppi Non-Responder e Responder al T0. L'analisi statistica principale includerà un approccio multivariato per il controllo dei confondenti. Il livello di significatività sarà fissato su alfa = 0,05 considerando la correzione per confronti multipli, ove appropriato.