Profilowanie biochemiczne pacjentów z migreną (SPHERA_WP1_1)

Poprzednie dowody wykazały, że układ endokannabidiomowy (eCBome) ulega zmianie u pacjentów z migreną, co wskazuje na: i) zmienioną ekspresję genów enzymów katabolizujących (MAGL i FAAH) u pacjentów z migreną epizodyczną i przewlekłą w porównaniu ze zdrową grupą kontrolną; ii) zmienione obwodowe poziomy endokannabinoidopodobnego lipidu palmitoiloetanoloamidu (PEA) z dowodami zwiększonego poziomu PEA podczas ostrej fazy migreny.

Pomimo wysokiej skuteczności i tolerancji przeciwciał monoklonalnych mAb skierowanych przeciwko peptydowi związanemu z genem kalcytoniny (mAb), dowody z RCT i badań rzeczywistych wykazują, że mAb zawodzą u 40% pacjentów. Pacjenci ci mogą mieć fenotyp niezależny od CGRP, potencjalnie powiązany z dysfunkcją eCBome.

Podstawowym celem jest przeprowadzenie głębokiego fenotypowania całej kohorty pacjentów z migreną, porównując podgrupy pacjentów, którzy odpowiedzą na leczenie mAb (mianowicie tych pacjentów, którzy osiągnęli redukcję miesięcznych dni z migreną >/= 50%) w porównaniu z grupą nie -Grupa Respoder (mianowicie ci pacjenci, którzy osiągnęli redukcję miesięcznych dni migrenowych < 50%).

Ocenimy neuropeptydy, mikroRNA, cytokiny zapalne i metabolity kinureniny. Odkrycia te pozwolą na identyfikację sygnatury panelu wielu biomarkerów u pacjentów z migreną opornych na specjalnie ukierunkowane terapie zapobiegawcze i potencjalnie ujawniających inne cele molekularne.

PROJEKT BADANIA:

Badanie to jest częścią projektu SPHERA finansowanego przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (GR-2021-12372429). Do badania będą przyjmowani pacjenci spośród pacjentów przychodni Instytutu IRCCS Mondino (Pawia) i Oddziału Neurologii Uniwersytetu w L'Aquila (Avezzano).

Będziemy zbierać dane przed rozpoczęciem leczenia mAb (linia bazowa-T0) i po trzech miesiącach (T1) leczenia mAb. Zidentyfikujemy grupy Repsonder i Non-responder, a następnie wykonamy profilowanie biochemiczne dwóch podgrup w T0 i T1.

METODY:

Wszyscy pacjenci zostaną poddani profilowaniu biochemicznemu, które obejmie analizę:

• system eCBome: poziomy mRNS FAAH, MAGL, DAGL, NAPE, NAAA w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej,
• poziomy AEA, 2-AG, PEA i OEA w osoczu; CGRP, PACAP i VIP; IL-1beta, TNF-alfa, IL-4 i IL-10; kwasy kynurenowy i chinolinowy;
• miR-382-5p, miR-34a, miR-30a i miR-155 w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej,
• analiza mikrobioty w kale pacjentów.

Próbki biochemiczne będziemy pobierać w godzinach od 9:00 do 11:00, aby uniknąć wpływu na rytm dobowy. Cała ocena zostanie przeprowadzona w fazie międzynapadowej migreny.

Przyjęte zostaną następujące metody zbierania:

• Analiza mRNA i mikroRNA w PBMC. Próbki krwi będą pobierane do probówek z kwasem etylenodiaminotetraoctowym, najpierw wyizolujemy PBMC i całkowity RNA. Ubikwityna C i U6 będą pełnić funkcję genów porządkowych dla genów kodujących enzymy eCBome i miRNA.
• kwas kynurenowy i kwas chinolinowy, AEA, PEA, 2-AG i OEA zostaną oznaczone zgodnie z opublikowaną metodą Gao (Gao, 2020). Poziom metabolitów kinureniny będzie mierzony zgodnie z metodą opisaną przez Fuertiga (Fuertig, 2016).
• Poziomy CGRP alfa, PACAP-38 i VIP będą mierzone przy użyciu komercyjnego testu immunoenzymatycznego
• Poziom cytokiny IL-1beta, TNF-alfa, IL-4, IL-10 będzie mierzony za pomocą automatycznego systemu testów immunologicznych Ella z panelem testowym Simple Plex.
• Analiza mikrobiomu: po prawidłowym pobraniu i zakonserwowaniu próbki kału zostaną przekazane do Translacyjnej Jednostki Badań Neuronaczyniowych (Fundacja IRCCS Mondino) w celu ekstrakcji DNA.

ANALIZA STATYSTYCZNA Obliczenie wielkości próby definiuje się dla wyniku pierwotnego (wyrażenie MAGL), natomiast analizę mocy przeprowadza się dla drugiego wyniku pierwotnego (wyrażenie FAAH).

Według wstępnych danych z pracy Greco 2021 sugerujących stosunek pomiędzy osobami nie odpowiadającymi i odpowiadającymi na leczenie: 2:3 i ekspresją genu MAGL: 8±10 RQ u osób nie odpowiadających i 3±4 RQ u osób odpowiadających, minimalna wielkość próby wynosi 88 pacjentów z migreną (53 osoby odpowiadające na leczenie i 35 osób niereagujących), aby uzyskać przedział ufności 95% i moc 80%.

Analiza normalności zostanie przeprowadzona w celu oceny metod parametrycznych i nieparametrycznych.

Przeprowadzimy analizę jednoczynnikową w celu wyszukania różnic w parametrach demograficznych, klinicznych i biochemicznych pomiędzy grupami osób nie odpowiadających i odpowiadających na leczenie w T0. Główna analiza statystyczna będzie obejmować wielowymiarowe podejście do kontroli czynników zakłócających. Poziom istotności zostanie ustalony na poziomie alfa = 0,05, z uwzględnieniem, w stosownych przypadkach, korekty z tytułu wielokrotnych porównań.