Perfil bioquímico de pacientes com enxaqueca (SPHERA_WP1_1)

Evidências anteriores mostraram que o sistema endocanabidioma (eCBome) está alterado em pacientes com enxaqueca demonstrando: i) expressão gênica alterada de enzimas catabolizantes (MAGL e FAAH) em pacientes com enxaqueca episódica e crônica em comparação com controles saudáveis; ii) níveis periféricos alterados do lípido palmitoiletanolamida (PEA) semelhante ao endocanabinóide, com evidência de níveis aumentados de PEA durante a fase aguda da enxaqueca.

Apesar da elevada eficácia e tolerabilidade dos anticorpos monoclonais mAbs dirigidos contra o péptido relacionado com o gene da calcitonina (mAbs), as evidências de ensaios clínicos randomizados e estudos da vida real demonstram que os mAbs falham em 40% dos pacientes. Esses pacientes podem apresentar um fenótipo não dependente de CGRP, potencialmente ligado à disfunção do eCBome.

O objetivo principal é realizar uma fenotipagem profunda de toda a coorte de pacientes com enxaqueca, comparando os subgrupos daqueles pacientes que responderão ao tratamento com mAbs (ou seja, aqueles pacientes que alcançaram uma redução de dias mensais de enxaqueca >/= 50%) em comparação com os não -Grupo Respoder (nomeadamente aqueles pacientes que alcançaram uma redução dos dias mensais de enxaqueca <50%).

Avaliaremos neuropeptídeos, microRNAs, citocinas inflamatórias e metabólitos de quinurenina. Essas descobertas permitirão a identificação de uma assinatura de painel multibiomarcadores de pacientes com enxaqueca que resistem a tratamentos preventivos específicos e potencialmente revelando outros alvos moleculares.

DESENHO DE ESTUDO:

Este estudo faz parte do projeto SPHERA com financiamento do Ministério da Saúde italiano (GR-2021-12372429). Os pacientes serão inscritos entre aqueles que frequentam o ambulatório do IRCCS Mondino Institute (Pavia) e do Departamento de Neurologia da Universidade de L'Aquila (Avezzano).

Coletaremos dados antes do início dos mAbs (linha de base-T0) e após três meses (T1) de tratamento com mAbs. Identificaremos os grupos Repsonder e Não respondedores e, em seguida, realizaremos o perfil bioquímico dos dois subgrupos em T0 e T1.

MÉTODOS:

Todos os pacientes serão submetidos a um perfil bioquímico que incluirá análise de:

• Sistema eCBome: níveis mRNS de FAAH, MAGL, DAGL, NAPE, NAAA em células mononucleares do sangue periférico,
• níveis plasmáticos de AEA, 2-AG, PEA e OEA; CGRP, PACAP e VIP; IL-1beta, TNF-alfa, IL-4 e IL-10; ácidos cinurênico e quinolínico;
• miR-382-5p, miR-34a, miR-30a e miR-155 em células mononucleares do sangue periférico,
• análise espingarda da microbiota nas fezes dos pacientes.

Coletaremos amostras bioquímicas entre 9h e 11h para evitar influência do ritmo circadiano. Toda avaliação será realizada na fase interictal da enxaqueca.

Serão adotados os seguintes métodos de coleta:

• Análise de mRNA e microRNA em PBMCs. Amostras de sangue serão coletadas em tubos de ácido etilenodiamino tetraacético, primeiro isolaremos PBMCs e RNA total. A ubiquitina C e U6 atuarão como genes de manutenção para genes que codificam as enzimas eCBome e miRNAs.
• ácido cinurênico e ácido quinolínico, AEA, PEA, 2-AG e OEA serão determinados de acordo com o método publicado por Gao (Gao, 2020). Os níveis do metabólito da cinurenina serão medidos de acordo com o método descrito por Fuertig (Fuertig, 2016).
• Os níveis de CGRP alfa, PACAP-38 e VIP serão medidos usando um ensaio imunoenzimático comercial.
• As citocinas IL-1beta, TNF-alfa, IL-4, IL-10 serão medidas pelo Ella Automated Immunoassay System com um painel de ensaio Simple Plex.
• Análise do microbioma: após correta coleta e preservação das amostras de fezes, elas serão entregues à Unidade de Pesquisa Neurovascular Translacional (Fundação IRCCS Mondino) para extração de DNA.

ANÁLISE ESTATÍSTICA O cálculo do tamanho da amostra é definido para o desfecho primário (expressão MAGL), enquanto uma análise de poder é realizada para o desfecho coprimário (expressão FAAH).

De acordo com dados preliminares do trabalho de Greco 2021 sugerindo uma proporção entre Não respondedores e Respondentes: 2:3 e expressão do gene MAGL: 8±10 RQ em Não respondedores e 3±4 RQ em Respondentes, o tamanho mínimo da amostra é de 88 pacientes com enxaqueca (53 respondedores e 35 não respondedores) para ter um intervalo de confiança de 95% e poder de 80%.

A análise de normalidade será realizada para avaliar métodos paramétricos ou não paramétricos.

Realizaremos uma análise univariada para procurar diferenças nos parâmetros demográficos, clínicos e bioquímicos entre os grupos Não Respondentes e Respondentes em T0. A análise estatística principal incluirá uma abordagem multivariada para controlar fatores de confusão. O nível de significância será estabelecido em alfa = 0,05 considerando correção para comparações múltiplas quando apropriado.