Perfil bioquímico de pacientes con migraña (SPHERA_WP1_1)

Evidencia previa demostró que el sistema endocannabidioma (eCBome) está alterado en pacientes con migraña, lo que demuestra: i) expresión genética alterada de enzimas catabolizantes (MAGL y FAAH) en pacientes con migraña episódica y crónica en comparación con controles sanos; ii) niveles periféricos alterados del lípido palmitoiletanolamida (PEA) similar a un endocannabinoide con evidencia de niveles elevados de PEA durante la fase de migraña aguda.

A pesar de la alta eficacia y tolerabilidad de los anticuerpos monoclonales mAb dirigidos contra el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (mAb), la evidencia de ECA y estudios de la vida real demuestra que los mAb fallan en el 40% de los pacientes. Estos pacientes pueden tener un fenotipo no dependiente de CGRP, potencialmente relacionado con la disfunción del eCBome.

El objetivo principal es realizar un fenotipado profundo de toda la cohorte de pacientes con migraña comparando los subgrupos de aquellos pacientes que responderán al tratamiento con mAbs (es decir, aquellos pacientes que lograron una reducción de los días mensuales con migraña>/= 50%) en comparación con los no -Grupo Respoder (es decir, aquellos pacientes que lograron una reducción de días mensuales de migraña < 50%).

Evaluaremos neuropéptidos, microARN, citocinas inflamatorias y metabolitos de quinurenina. Estos hallazgos permitirán la identificación de un panel de múltiples biomarcadores característicos de pacientes con migraña que se resisten a tratamientos preventivos específicamente dirigidos y potencialmente revelarán otros objetivos moleculares.

DISEÑO DEL ESTUDIO:

Este estudio forma parte del proyecto SPHERA con financiación del Ministerio de Salud italiano (GR-2021-12372429). Los pacientes se inscribirán entre los que asistan a la clínica ambulatoria del Instituto IRCCS Mondino (Pavia) y Departamento de Neurología de la Universidad de L'Aquila (Avezzano).

Recopilaremos datos antes de que comiencen los mAb (línea de base-T0) y después de tres meses (T1) de tratamiento con mAb. Identificaremos los grupos de respondedores y no respondedores y luego realizaremos perfiles bioquímicos de los dos subgrupos en T0 y T1.

MÉTODOS:

Todos los pacientes se someterán a un perfil bioquímico que incluirá análisis de:

• Sistema eCBome: niveles mRNS de FAAH, MAGL, DAGL, NAPE, NAAA en células mononucleares de sangre periférica,
• niveles plasmáticos de AEA, 2-AG, PEA y OEA; CGRP, PACAP y VIP; IL-1beta, TNF-alfa, IL-4 e IL-10; ácidos quinurénico y quinolínico;
• miR-382-5p, miR-34a, miR-30a y miR-155 en células mononucleares de sangre periférica,
• Análisis de escopeta de la microbiota en las heces de los pacientes.

Recogeremos muestras bioquímicas entre las 9 y las 11 a. m. para evitar la influencia del ritmo circadiano. Toda evaluación se realizará en la fase interictal de migraña.

Se adoptarán los siguientes métodos de recaudación:

• Análisis de ARNm y microARN en PBMC. Las muestras de sangre se recolectarán dentro de tubos de ácido etilendiaminotetraacético, primero aislaremos las PBMC y el ARN total. La ubiquitina C y U6 actuarán como genes de mantenimiento para los genes que codifican las enzimas eCBome y los miARN.
• El ácido quinurénico y el ácido quinolínico, AEA, PEA, 2-AG y OEA se determinarán según el método publicado por Gao (Gao, 2020). Los niveles del metabolito quinurenina se medirán según el método descrito por Fuertig (Fuertig, 2016).
• Los niveles de CGRP alfa, PACAP-38 y VIP se medirán mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas comercial.
• Las citoquinas IL-1beta, TNF-alfa, IL-4, IL-10 se medirán mediante el sistema de inmunoensayo automatizado Ella con un panel de ensayo Simple Plex.
• Análisis del microbioma: tras la correcta recogida y conservación de las muestras de heces, se entregarán a la Unidad de Investigación Neurovascular Traslacional (IRCCS Fundación Mondino) para la extracción de ADN.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO El cálculo del tamaño de la muestra se define para el resultado primario (expresión MAGL), mientras que se realiza un análisis de poder para el resultado coprimario (expresión FAAH).

Según datos preliminares del trabajo de Greco 2021 que sugieren una relación entre los que no responden y los que responden: 2:3 y la expresión del gen MAGL: 8 ± 10 RQ en los que no responden y 3 ± 4 RQ en los que responden, el tamaño mínimo de la muestra es de 88 pacientes con migraña (53 respondedores y 35 NO respondedores) para tener un intervalo de confianza del 95% y una potencia del 80%.

Se realizará un análisis de normalidad para evaluar métodos paramétricos o no paramétricos.

Realizaremos un análisis univariado para buscar diferencias en parámetros demográficos, clínicos y bioquímicos entre los grupos de no respondedores y de respondedores en T0. El análisis estadístico principal incluirá un enfoque multivariado para controlar los factores de confusión. El nivel de significancia se fijará en alfa = 0,05 considerando la corrección para comparaciones múltiples cuando corresponda.