Probiotika til forebyggelse af hepatocellulært karcinom i skrumpelever

Forskningsspørgsmål Forhindrer moduleringen af ​​tarmmikrobiom med probiotika udviklingen af ​​hepatocellulært carcinom hos patienter med cirrhose? Formålet med denne undersøgelse er at evaluere effektiviteten af ​​probiotika til at reducere forekomsten af ​​hepatocellulært karcinom hos patienter med Child Pugh A-B cirrhose med portal hypertension.

Metoder Studiedesign. Fase III interventionel, multicenter, randomiseret, dobbeltblindet, placebokontrolleret forsøg.

Følgende undersøgelse vil blive udført efter CONSORT retningslinjer. Scenarie og midlertidighed. Studiet vil blive udviklet i Argentina, herunder patientplejecentre med følgende inklusions- og eksklusionskriterier, fra 1. april/2019 (rekrutteringsfase på 12 måneder) indtil den sidste indskrevne patient gennemfører opfølgningen på 3 år fra randomisering.

Intervention. Testlægemiddel(er). Både probiotika og placebo vil blive præsenteret i samme beholder, form og farve.

Navn på det aktive stof Hver 50 ml flaske indeholder Lactobacillus casei 3,3 x 107 CFU/dag, Lactobacillus plantarum 3,3 x 107 CFU/dag, Streptococcus faecalis 3,3 x 107 CFU/dag og Bifidobacterium brevis 1,0 x 106 CLOFURA® dag (BIOSIDOF CLOFURA®, dag). SA, Argentina).

Administrationsmåde: Oral 5 ml oralt hver 12. time i 10 på hinanden følgende dage om måneden. Behandlingens varighed: 2 cyklusser med kontinuerlig behandling om året i en 3-årig periode (6 cyklusser). Hver cyklus inkluderer tre måneders behandling, efterfulgt af en pause på tre måneder.

Referenceintervention. Navn på det aktive stof: Placebo. Administrationsmåde: Oral 5 ml oralt hver 12. time i 10 på hinanden følgende dage om måneden. Behandlingens varighed: 2 cyklusser med kontinuerlig behandling om året i en 3-årig periode (6 cyklusser). Hver cyklus inkluderer tre måneders behandling, efterfulgt af en pause på tre måneder.

** Ligeledes vil begge arme eksplicit anmode om ikke-indtagelse af alkohol og indtagelse af en ikke-hyperkalorisk middelhavsdiæt gennem hele undersøgelsen for alle patienter.

Metodik. Patienter, der opfylder de førnævnte inklusions- og eksklusionskriterier og har gennemført alle screeningstests med succes, vil blive behandlet med standardtesten eller behandlingsmedicinen i henhold til kliniske retningslinjer gennem en 1:1 randomiseringsordning.

Randomiseringen vil være stratificeret i blokke i henhold til tidligere identificerede prognostiske variabler og for at undgå potentielle forvirrende variabler og/eller effektmodifikatorer fordelt tilfældigt på en ubalanceret måde: Child Pugh score B og blodpladetal <100.000/mm3. Randomiseringen vil blive udført i henhold til opgaven ved hjælp af numre, der tidligere er lavet af en blindet forsker og uafhængigt af kliniske karakteristika og kontakt med patienterne. Alle numre i randomiseringen vil blive gemt i lukkede uigennemsigtige konvolutter og vil blive tildelt fortløbende i henhold til rækkefølgen af ​​inklusion i protokollen.

*Alle de udviklede hændelser, både primære og sekundære gennem hele undersøgelsen, vil blive evalueret af en blindet og uafhængig komité ud fra baselinevariabler og randomiseringsallokering. Kliniske hændelser vil blive overvåget og re-evalueret af denne komité, som vil bestå af 3 efterforskere.

Eksponeringsvariable.

• Kliniske data

• Perifere blodprøver til måling af cytokiner, LPS og ekspression af TLR 4.

  • Cytokiner: Målingen af ​​cytokiner vil blive foretaget fra plasma fra perifere blodprøver. Niveauerne af følgende cytokiner vil blive kvantificeret i pg/ml: IL-6, TNF-α og endotoksæmi eller bakterielt lipopolysaccharid (LPS). Operatørerne af denne måling vil blive blindet over for enhver klinisk, mikrobiom og behandlingstildeling. Prøver, der skal udtages fra hver person: to 10 ml rør med fuldblod, et med EDTA (natriumethylendiamintetraacetat) og et andet uden antikoagulant, til brug i rutinelaboratorieundersøgelser og til måling af cytokiner (IL6 og TNF alfa) og endotoksiner ( LPS). Kvantificering af plasmacytokiner: Kommercielle reagenser af enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) vil blive brugt til at måle niveauerne af cytokiner til stede i patienters plasma. Koncentrationerne af TNF alfa og IL-6 vil blive målt med kommercielle reagenser af eBioscience, affymetrix eller et lignende kommercielt reagens, der er tilgængeligt på markedet, nøje efter instruktionerne fra de respektive producenter. Til kvantificeringen af ​​cytokinerne vil kurverne blive lavet med de tilsvarende koncentrationsstandarder.
  • Kvantificering af endotoksiner i plasma eller serum: Måling af bakteriel LPS vil blive udført med Limulus Amebocyte Lysate Assay (LAL), Biosafe Srl kromogent endepunktsreagens eller lignende, parallelt med standardernes koncentrationskurve. Producentens instruktioner vil blive fulgt.
  • Ekspression af TLR 4 i mononukleære celler i perifert blod: ekspressionen af ​​TLR 4 i mononukleære celler vil blive kvantificeret ved real-time PCR-teknik ved anvendelse af specifikke primere.

  • Afføringsprøver til tarmmikrobiom evaluering.

    1. Indsamlingsmetode: En prøve af spontan fækal afføring vil blive opsamlet på et hvilket som helst tidspunkt af dagen i en medfølgende manifold, idet man undgår kontakt med toiletter/lugtfri materialer. Når prøven er opsamlet, vil den passende hætte opsamler blive placeret i en sikkerhedspose og inde i en kitboks. Disse prøver vil blive opbevaret frosset ved -70º. Hver afføringsprøve skal være korrekt mærket. Senere vil prøver blive udtaget til endelig behandling.
    2. Analyse: Fækal afføring vil blive indsamlet for at analysere tarmmikrobiomet ved hjælp af PCR-teknikken, Ilumina, ved at analysere V3-V4-regionerne af 16sRNA på det bioteknologiske institut i Rosario (INDEAR, Rosario, Argentina). Den 16S ribosomale underenhed af rRNA vil blive analyseret bakteriel, amplificeret ved hjælp af PCR-metoden (20 cyklusser) og derefter en anden runde amplifikation for at inkorporere multiplex-adaptere (stregkoder) (10 cyklusser). I hver procedure vil der blive foretaget to målinger for at undgå skævheder i amplifikationsinformation. Den massive sekventering vil blive udført på et illumina MiSeq-team fra HERITAS-instituttet (CIBIC + INDEAR) i 2x300-tilstand for endelig at opnå minimum 40.000 sekvenser pr. person. Kvaliteten af ​​de rå data vil blive evalueret af FastQC, og oplysningerne om par-ender af Illumina vil blive kombineret ved hjælp af PEAR (v0.9.10). Aflæsningerne filtreres derefter efter Q30-kvalitet, og duplikaterne og PCR-kimærerne elimineres ved hjælp af UCHIME. De filtrerede sekvenser vil blive grupperet i Operational Taxonomic Units (OTU'er) med 97 % lighed med deres egen strategi implementeret i QIIME (v1.91). Operatørerne af denne måling vil være blinde over for de kliniske, mikrobiom og primære hændelsesvariabler.
• Følgende målinger vil blive udført hver 6. måned i hvert forsøgsperson, der er tilmeldt indtil slutningen af ​​undersøgelsen eller udviklingen af ​​den primære hændelse: vægt og højde, samtidig medicinering, fuldstændig fysisk undersøgelse, laboratorietest, Child Pugh-score, abdominal ultralyd.
• Longitudinel prøvetagning af tarmmikrobiom og cytokiner. En anden cytokinmåling vil blive foretaget fra serum fra perifert blod og tarmmikrobiomprøver i fækale prøver hos alle patienter inkluderet i undersøgelsen ved slutningen af ​​den første behandlingscyklus (3. måned siden randomisering eller 12 uger) og ved slutningen af ​​undersøgelsen (sidste cyklus) ved hjælp af samme metode beskrevet ovenfor.

Overholdelse og opfølgning: Alle patienter vil fortsætte i protokollen indtil udviklingen af ​​den primære hændelse eller indtil slutningen af ​​den, efter at have gennemført en post-randomiseringsopfølgning på 3 år. Adskillige foranstaltninger vil blive gennemført for at styrke overholdelse af behandling i både arme og strategier for at undgå tab af opfølgning. Overholdelse af behandlingscompliance vil blive defineret i 80 % af de tabletter, der leveres til begge arme.

Prøvestørrelsesberegning og statistisk analyse: Der tages en tosidet statistisk værdi, α eller type I fejl på 5 % (p værdi <0,05) og en effekt eller fejl type II eller β på 0,20 (potens 80 %). Risikoen for HCC i hver arm vil blive sammenlignet ved hjælp af Cox-regressionsanalyse med Hazard Ratios (HR) og 95 % konfidensintervaller, og det antal, der skal behandles for at forhindre et klinisk resultat, vil blive beregnet efter intention-to-treat princippet. . Da den kumulative forekomst af HCC fra tidligere data fra litteraturen er 1-6 % om året, blev en relativ risikoreduktion af HCC-udvikling i løbet af en 3-årig periode i interventionsarmen estimeret til at være klinisk relevant med en relativ forskel på 30 %. svarende til en HR på 0,7. For hver arm estimerede en prøvestørrelse på 140 forsøgspersoner, med en samlet population på 280 patienter, antallet af primære hændelser i 28.

Alle statistiske analyser vil blive udført med STATA version 14.0.

Analyse af mikrobiom metadata. Den bioinformatiske analyse af dataene vil blive udført ved hjælp af en tilpasset QIIME-pipeline. Til estimering af differentiel overflod mellem grupperne bruger vi DESeq2-pakken.