Probiotika in der Prävention von hepatozellulärem Karzinom bei Zirrhose

Forschungsfrage Verhindert die Modulation des Darmmikrobioms mit Probiotika die Entstehung eines hepatozellulären Karzinoms bei Patienten mit Zirrhose? Das Ziel dieser Studie ist es, die Wirksamkeit von Probiotika bei der Verringerung der Inzidenz von hepatozellulärem Karzinom bei Patienten mit Child-Pugh-A-B-Zirrhose mit portaler Hypertonie zu bewerten.

Methoden Studiendesign. Interventionelle, multizentrische, randomisierte, doppelblinde, placebokontrollierte Phase-III-Studie.

Die folgende Studie wird gemäß den CONSORT-Richtlinien durchgeführt. Szenario und Zeitlichkeit. Die Studie wird in Argentinien einschließlich Patientenversorgungszentren mit den folgenden Einschluss- und Ausschlusskriterien ab dem 1. April 2019 (Rekrutierungsphase von 12 Monaten) entwickelt, bis der letzte aufgenommene Patient die Nachbeobachtung von 3 Jahren nach der Randomisierung abgeschlossen hat.

Intervention. Testdroge(n). Sowohl das Probiotikum als auch das Placebo werden in demselben Behälter, in derselben Form und in derselben Farbe angeboten.

Name des Wirkstoffs Jede 50-ml-Flasche enthält Lactobacillus casei 3,3 x 107 KBE/Tag, Lactobacillus plantarum 3,3 x 107 KBE/Tag, Streptococcus faecalis 3,3 x 107 KBE/Tag und Bifidobacterium brevis 1,0 x 106 KBE/Tag (BIOFLORA®, BIOSIDUS SA, Argentinien).

Art der Verabreichung: Oral 5 ml oral alle 12 Stunden an 10 aufeinanderfolgenden Tagen pro Monat. Behandlungsdauer: 2 Zyklen kontinuierlicher Behandlung pro Jahr über einen Zeitraum von 3 Jahren (6 Zyklen). Jeder Zyklus umfasst eine dreimonatige Behandlung, gefolgt von einer dreimonatigen Auszeit.

Referenzeingriff. Name des Wirkstoffs: Placebo. Art der Verabreichung: Oral 5 ml oral alle 12 Stunden an 10 aufeinanderfolgenden Tagen pro Monat. Behandlungsdauer: 2 Zyklen kontinuierlicher Behandlung pro Jahr über einen Zeitraum von 3 Jahren (6 Zyklen). Jeder Zyklus umfasst eine dreimonatige Behandlung, gefolgt von einer dreimonatigen Auszeit.

**Ebenso werden beide Arme ausdrücklich den Verzicht auf Alkoholkonsum und den Verzehr einer nicht-hyperkalorischen Mittelmeerdiät während der gesamten Studie für alle Patienten fordern.

Methodik. Patienten, die die oben genannten Ein- und Ausschlusskriterien erfüllen und alle Screening-Tests erfolgreich abgeschlossen haben, werden mit dem Standard-Test- oder Behandlungsmedikament gemäß den Richtlinien der klinischen Praxis im Rahmen eines 1: 1-Randomisierungsschemas behandelt.

Die Randomisierung erfolgt in Blöcken nach zuvor identifizierten prognostischen Variablen und um potenzielle Störvariablen und/oder Effektmodifikatoren zu vermeiden, die zufällig unausgewogen verteilt sind: Child-Pugh-Score B und Thrombozytenzahl < 100.000/mm3. Die Randomisierung erfolgt entsprechend der Zuordnung anhand zuvor von einem verblindeten Forscher vorgenommener Nummern und unabhängig von klinischen Merkmalen und Patientenkontakten. Alle Nummern der Randomisierung werden in verschlossenen undurchsichtigen Umschlägen aufbewahrt und entsprechend der Reihenfolge der Aufnahme in das Protokoll fortlaufend vergeben.

* Alle während der Studie entwickelten Ereignisse, sowohl primär als auch sekundär, werden von einem verblindeten und unabhängigen Ausschuss anhand von Baseline-Variablen und Randomisierungszuordnung bewertet. Klinische Ereignisse werden von diesem Komitee, das aus 3 Prüfärzten bestehen wird, überwacht und neu bewertet.

Expositionsvariablen.

• Klinische Daten

• Periphere Blutproben zur Messung von Zytokinen, LPS und Expression von TLR 4.

  • Zytokine: Die Messung von Zytokinen erfolgt aus Plasma peripherer Blutproben. Die Spiegel der folgenden Zytokine werden in pg/ml quantifiziert: IL-6, TNF-α und Endotoxämie oder bakterielles Lipopolysaccharid (LPS). Die Bediener dieser Messung werden gegenüber jeglicher klinischen, Mikrobiom- und Behandlungszuordnung verblindet. Von jeder Person zu entnehmende Proben: zwei 10-ml-Röhrchen mit Vollblut, eines mit EDTA (Natriumethylendiamintetraacetat) und eines ohne Antikoagulans, zur Verwendung in routinemäßigen Laboruntersuchungen und bei der Messung von Zytokinen (IL6 und TNF alpha) und Endotoxinen ( LPS). Quantifizierung von Zytokinen im Plasma: Kommerzielle Reagenzien des enzymgebundenen Immunadsorptionstests (ELISA) werden verwendet, um die Konzentrationen von Zytokinen zu messen, die im Plasma von Patienten vorhanden sind. Die Konzentrationen von TNF alpha und IL-6 werden mit handelsüblichen Reagenzien von eBioscience, affymetrix oder einem ähnlichen handelsüblichen Reagenz, das auf dem Markt erhältlich ist, unter strikter Einhaltung der Anweisungen der jeweiligen Hersteller gemessen. Zur Quantifizierung der Zytokine werden die Kurven mit den entsprechenden Konzentrationsstandards erstellt.
  • Quantifizierung von Endotoxinen in Plasma oder Serum: Die Messung von bakteriellem LPS wird mit dem Limulus-Amöbozyten-Lysat-Assay (LAL), dem chromogenen Endpunktreagenz von Biosafe Srl oder ähnlichem parallel zur Konzentrationskurve der Standards durchgeführt. Die Anweisungen des Herstellers werden befolgt.
  • Expression von TLR 4 in mononukleären Zellen des peripheren Blutes: Die Expression von TLR 4 in mononukleären Zellen wird durch Echtzeit-PCR-Technik unter Verwendung spezifischer Primer quantifiziert.

  • Stuhlproben zur Beurteilung des Darmmikrobioms.

    1. Entnahmemethode: Eine Probe des spontanen Stuhlgangs wird zu jeder Tageszeit in einem mitgelieferten Verteiler entnommen, wobei der Kontakt mit Toiletten-/geruchlosen Materialien vermieden wird. Sobald die Probe entnommen ist, wird der entsprechend verschlossene Sammler in einen Sicherheitsbeutel und in eine Kit-Box gelegt. Diese Proben werden gefroren bei -70º gelagert. Jede Kotprobe muss ordnungsgemäß gekennzeichnet sein. Später werden die Proben für die endgültige Verarbeitung aliquotiert.
    2. Analyse: Stuhlproben werden gesammelt, um das Darmmikrobiom unter Verwendung der PCR-Technik, Ilumina, zu analysieren, wobei die V3-V4-Regionen der 16sRNA am Biotechnologie-Institut von Rosario (INDEAR, Rosario, Argentinien) analysiert werden. Die ribosomale 16S-Untereinheit der rRNA wird bakteriell analysiert, wobei die PCR-Methode (20 Zyklen) und dann eine zweite Amplifikationsrunde zum Einbau von Multiplex-Adaptern (Barcodes) (10 Zyklen) amplifiziert werden. Bei jedem Verfahren werden zwei Messungen durchgeführt, um Verzerrungen der Amplifikationsinformationen zu vermeiden. Die massive Sequenzierung wird auf einem illumina MiSeq-Team des HERITAS-Instituts (CIBIC + INDEAR) im 2x300-Modus durchgeführt, um schließlich ein Minimum von 40.000 Sequenzen pro Person zu erhalten. Die Qualität der Rohdaten wird von FastQC bewertet und die Informationen von Pair-Ends von Illumina werden mit PEAR (v0.9.10) kombiniert. Die Messwerte werden dann nach Q30-Qualität gefiltert und die Duplikate und PCR-Chimären werden mit UCHIME eliminiert. Die gefilterten Sequenzen werden in Operational Taxonomic Units (OTUs) mit 97 % Ähnlichkeit mit ihrer eigenen in QIIME (v1.91) implementierten Strategie geclustert. Die Bediener dieser Messung sind blind gegenüber den klinischen, Mikrobiom- und primären Ereignisvariablen.
• Die folgenden Messungen werden alle 6 Monate bei jedem aufgenommenen Probanden bis zum Ende der Studie oder Entwicklung des primären Ereignisses durchgeführt: Gewicht und Größe, begleitende Medikation, vollständige körperliche Untersuchung, Labortests, Child-Pugh-Score, Ultraschall des Abdomens.
• Längsschnitt von Darmmikrobiom und Zytokinen. Bei allen in die Studie eingeschlossenen Patienten wird am Ende des ersten Behandlungszyklus (3. Monat seit Randomisierung oder 12 Wochen) und am Ende der Studie eine zweite Zytokinmessung aus Serum aus peripherem Blut und Darmmikrobiomproben in Stuhlproben durchgeführt (letzter Zyklus) unter Verwendung der gleichen oben beschriebenen Methodik.

Einhaltung und Nachsorge: Alle Patienten werden das Protokoll bis zur Entwicklung des primären Ereignisses oder bis zu dessen Ende fortsetzen, nachdem sie eine Nachbeobachtung nach der Randomisierung von 3 Jahren abgeschlossen haben. Es werden mehrere Maßnahmen durchgeführt, um die Einhaltung der Behandlung in beiden Armen und Strategien zur Vermeidung von Nachbeobachtungsverlusten zu stärken. Die Einhaltung der Behandlungscompliance wird bei 80 % der für beide Arme abgegebenen Tabletten definiert.

Berechnung des Stichprobenumfangs und statistische Analyse: Es wird ein zweiseitiger statistischer Wert genommen, α oder Fehler 1. Art von 5 % (p-Wert < 0,05) und eine Trennschärfe oder Fehler 1. Art oder β von 0,20 (Stärke 80 %). Das HCC-Risiko in jedem Arm wird unter Verwendung einer Cox-Regressionsanalyse mit Hazard Ratios (HR) und 95%-Konfidenzintervallen verglichen und die Zahl, die zur Behandlung erforderlich ist, um ein klinisches Ergebnis zu verhindern, wird gemäß dem Intention-to-Treat-Prinzip berechnet . Da die kumulative HCC-Inzidenz aus früheren Daten aus der Literatur 1–6 % pro Jahr beträgt, wurde eine relative Risikoreduktion der HCC-Entwicklung während eines Zeitraums von 3 Jahren im Interventionsarm mit einer relativen Differenz von 30 % als klinisch relevant eingeschätzt, entspricht einer HR von 0,7. Für jeden Arm eine Stichprobengröße von 140 Probanden mit einer Gesamtpopulation von 280 Patienten für die Aufnahme, geschätzte Anzahl von primären Ereignissen in 28.

Alle statistischen Analysen werden mit STATA Version 14.0 durchgeführt.

Analyse von Mikrobiom-Metadaten. Die bioinformatische Analyse der Daten erfolgt über eine angepasste QIIME-Pipeline. Für die Schätzung der unterschiedlichen Häufigkeit zwischen den Gruppen verwenden wir das Paket DESeq2.