Probiotici nella prevenzione del carcinoma epatocellulare nella cirrosi

Domanda di ricerca La modulazione del microbioma intestinale con i probiotici previene lo sviluppo del carcinoma epatocellulare nei pazienti con cirrosi? Lo scopo di questo studio è valutare l'efficacia dei probiotici nel ridurre l'incidenza del carcinoma epatocellulare in pazienti con cirrosi di Child Pugh A-B con ipertensione portale.

Metodi Disegno dello studio. Studio interventistico di fase III, multicentrico, randomizzato, in doppio cieco, controllato con placebo.

Il seguente studio sarà condotto seguendo le linee guida del CONSORT. Scenario e temporalità. Lo studio sarà sviluppato in Argentina includendo i centri di assistenza ai pazienti con i seguenti criteri di inclusione ed esclusione, dal 1 aprile 2019 (fase di reclutamento di 12 mesi) fino a quando l'ultimo paziente arruolato completa il follow-up di 3 anni dalla randomizzazione.

Intervento. Test farmaco/i. Sia il probiotico che il placebo saranno presentati nello stesso contenitore, forma e colore.

Nome del principio attivo Ogni flacone da 50 ml contiene Lactobacillus casei 3,3 x 107 UFC/giorno, Lactobacillus plantarum 3,3 x 107 UFC/giorno, Streptococcus faecalis 3,3 x 107 UFC/giorno e Bifidobacterium brevis 1,0 x 106 UFC/giorno (BIOFLORA®, BIOSIDUS SA, Argentina).

Modo di somministrazione: Orale 5 ml per via orale ogni 12 ore per 10 giorni consecutivi al mese. Durata del trattamento: 2 cicli di trattamento continuo all'anno per un periodo di 3 anni (6 cicli). Ogni ciclo comprende tre mesi di trattamento, seguiti da un periodo di pausa di tre mesi.

Intervento di riferimento. Nome del principio attivo: Placebo. Modo di somministrazione: Orale 5 ml per via orale ogni 12 ore per 10 giorni consecutivi al mese. Durata del trattamento: 2 cicli di trattamento continuo all'anno per un periodo di 3 anni (6 cicli). Ogni ciclo comprende tre mesi di trattamento, seguiti da un periodo di pausa di tre mesi.

**Allo stesso modo, entrambi i bracci richiederanno esplicitamente il non consumo di alcol e il consumo di una dieta mediterranea non ipercalorica durante lo studio per tutti i pazienti.

Metodologia. I pazienti che soddisfano i suddetti criteri di inclusione ed esclusione e hanno completato con successo tutti i test di screening, saranno trattati con il test standard o il farmaco di trattamento secondo le linee guida della pratica clinica attraverso uno schema di randomizzazione 1: 1.

La randomizzazione sarà stratificata in blocchi in base a variabili prognostiche precedentemente identificate e al fine di evitare potenziali variabili confondenti e/o modificatori di effetti distribuiti casualmente in modo non bilanciato: Child Pugh score B e conta piastrinica <100.000/mm3. La randomizzazione sarà effettuata in base all'assegnazione mediante numeri precedentemente realizzati da un ricercatore cieco e indipendente dalle caratteristiche cliniche e dal contatto con i pazienti. Tutti i numeri della randomizzazione verranno archiviati in buste opache chiuse e verranno assegnati consecutivamente secondo l'ordine di inclusione nel protocollo.

*Tutti gli eventi sviluppati, sia primari che secondari durante lo studio, saranno valutati da un comitato cieco e indipendente dalle variabili di base e dall'assegnazione della randomizzazione. Gli eventi clinici saranno monitorati e rivalutati da questo comitato, che sarà composto da 3 ricercatori.

Variabili di esposizione.

• Dati clinici

• Prelievi di sangue periferico per la misura di citochine, LPS ed espressione di TLR 4.

  • Citochine: La misurazione delle citochine sarà effettuata dal plasma di campioni di sangue periferico. I livelli delle seguenti citochine saranno quantificati in pg/ml: IL-6, TNF-α ed endotossiemia o lipopolisaccaride batterico (LPS). Gli operatori di questa misurazione saranno all'oscuro di qualsiasi allocazione clinica, del microbioma e del trattamento. Campioni da prelevare da ogni individuo: due provette da 10 ml di sangue intero, una con EDTA (sodio etilendiammina tetraacetato) e un'altra senza anticoagulante, da utilizzare negli esami di laboratorio di routine e nella misurazione delle citochine (IL6 e TNF alfa) e delle endotossine ( LPS). Quantificazione delle citochine plasmatiche: per misurare i livelli di citochine presenti nel plasma dei pazienti verranno utilizzati reagenti commerciali del saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Le concentrazioni di TNF alfa e IL-6 saranno misurate con reagenti commerciali di eBioscience, affymetrix o un reagente commerciale simile disponibile sul mercato, seguendo rigorosamente le istruzioni dei rispettivi produttori. Per la quantificazione delle citochine, le curve saranno realizzate con i corrispondenti standard di concentrazione.
  • Quantificazione delle endotossine nel plasma o nel siero: La misurazione dell'LPS batterico sarà eseguita mediante Limulus Amebocyte Lysate Assay (LAL), reagente endpoint cromogenico di Biosafe Srl o simile, in parallelo con la curva di concentrazione degli standard. Saranno seguite le istruzioni del produttore.
  • Espressione di TLR 4 in cellule mononucleate di sangue periferico: l'espressione di TLR 4 in cellule mononucleate sarà quantificata mediante tecnica PCR real-time, utilizzando primer specifici.

  • Campioni di feci per la valutazione del microbioma intestinale.

    1. Metodo di raccolta: un campione di feci fecali spontanee verrà raccolto in qualsiasi momento della giornata in un collettore fornito evitando il contatto con il bagno/materiali inodori. Una volta prelevato il campione, il collettore opportunamente tappato verrà posto all'interno di un sacchetto di sicurezza e all'interno di una scatola del kit. Questi campioni saranno conservati congelati a -70º. Ogni campione fecale deve essere adeguatamente etichettato. Successivamente, i campioni verranno aliquotati per l'elaborazione finale.
    2. Analisi: Le feci fecali saranno raccolte per analizzare il microbioma intestinale utilizzando la tecnica PCR, Ilumina, analizzando le regioni V3-V4 del 16sRNA presso l'Istituto di biotecnologia di Rosario (INDEAR, Rosario, Argentina). La subunità ribosomiale 16S dell'rRNA sarà analizzata batterica, amplificata usando il metodo PCR (20 cicli) e quindi un secondo round di amplificazione per incorporare adattatori multiplex (codici a barre) (10 cicli). In ciascuna procedura, verranno effettuate due misurazioni per evitare distorsioni delle informazioni sull'amplificazione. Il massiccio sequenziamento sarà eseguito su un team illumina MiSeq dell'istituto HERITAS (CIBIC + INDEAR) in modalità 2x300 per ottenere finalmente un minimo di 40.000 sequenze per individuo. La qualità dei dati grezzi sarà valutata da FastQC e le informazioni dei pair-end di Illumina saranno combinate utilizzando PEAR (v0.9.10). Le letture vengono quindi filtrate in base alla qualità Q30 e i duplicati e le chimere PCR vengono eliminati utilizzando UCHIME. Le sequenze filtrate saranno raggruppate in unità tassonomiche operative (OTU) al 97% di somiglianza con la propria strategia implementata in QIIME (v1.91). Gli operatori di questa misurazione saranno ciechi rispetto alle variabili cliniche, del microbioma e degli eventi primari.
• Le seguenti misurazioni verranno eseguite ogni 6 mesi in ciascun soggetto arruolato fino alla fine dello studio o allo sviluppo dell'evento primario: peso e altezza, farmaci concomitanti, esame fisico completo, test di laboratorio, punteggio Child Pugh, ecografia addominale.
• Campionamento longitudinale del microbioma intestinale e delle citochine. Una seconda misurazione delle citochine verrà effettuata dal siero di campioni di sangue periferico e microbioma intestinale in campioni fecali in tutti i pazienti inclusi nello studio alla fine del primo ciclo di trattamento (3° mese dalla randomizzazione o 12 settimane) e alla fine dello studio (ultimo ciclo) utilizzando la stessa metodologia sopra descritta.

Aderenza e follow-up: tutti i pazienti continueranno nel protocollo fino allo sviluppo dell'evento primario o fino alla sua fine, dopo aver completato un follow-up post-randomizzazione di 3 anni. Saranno attuate diverse misure per rafforzare l'aderenza al trattamento in entrambi i bracci e strategie per evitare la perdita di follow-up. L'aderenza alla compliance al trattamento sarà definita nell'80% delle compresse consegnate per entrambi i bracci.

Calcolo della dimensione del campione e analisi statistica: verrà preso un valore statistico a due code, α o errore di tipo I del 5% (valore p <0,05) e una potenza o errore di tipo II o β di 0,20 (potenza dell'80%). Il rischio di HCC in ciascun braccio verrà confrontato utilizzando l'analisi di regressione di Cox con rapporti di rischio (HR) e intervalli di confidenza al 95% e verrà calcolato il numero necessario da trattare per prevenire un esito clinico, secondo il principio dell'intenzione di trattare . Poiché l'incidenza cumulativa di HCC dai dati precedenti della letteratura è dell'1-6% all'anno, una riduzione del rischio relativo di sviluppo di HCC durante un periodo di 3 anni nel braccio di intervento è stata stimata essere clinicamente rilevante con una differenza relativa del 30%, equivalente a un HR di 0,7. Per ciascun braccio, una dimensione del campione di 140 soggetti, con una popolazione totale da arruolare di 280 pazienti, numero stimato di eventi primari in 28.

Tutte le analisi statistiche saranno effettuate utilizzando STATA versione 14.0.

Analisi dei metadati del microbioma. L'analisi bioinformatica dei dati verrà effettuata utilizzando una pipeline QIIME personalizzata. Per la stima dell'abbondanza differenziale tra i gruppi utilizziamo il pacchetto DESeq2.