Eine Studie, die Teilnehmerdaten und Biospecimen sammelt, um pathogene Exosomen zu analysieren, die ein erhöhtes vaskuläres Demenzrisiko bei Personen mit Herpes -Zoster vermitteln. (R01)

Vaskuläre Demenz: vaskuläre Demenz ist die zweithäufigste Form der Demenz nach Alzheimer-Krankheit und ist im weitesten Sinne als Blutverlust des Gehirns und beeinträchtigt die Blut-Hirn-Barriere (BBB) ​​letzt (Thrombose) sind Mitwirkende und Risikofaktoren für die Entwicklung einer vaskulären Demenz. In jüngster Zeit wurden Viren als potenzielle Risikofaktoren identifiziert.

Varicella zoster virus (VZV) and vascular dysfunction: VZV is an exclusively human, double-stranded DNA alphaherpesvirus that produces varicella (chickenpox) then establishes latency within sensory and autonomic ganglionic neurons30-35 in >95% of adults in the U.S.36,37 With aging and immunosuppression, VZV reactivates in at least 1 von 3 Personen, die Herpes Zoster (Hz; Gürtelrose) und andere neurologische Erkrankungen mit oder ohne Ausschlag produzieren.38 Trotz der Verfügbarkeit von zwei Hz -Impfstoffen entwickeln sich mehr als 1 Million Amerikaner jährlich HZ.9 Weniger der Öffentlichkeit bekannt ist die Häufigkeit der VZV -Reaktivierung ohne Ausschlag (Zoster Sinus Herpete). Angesichts der Tatsache, dass VZV von Ganglion -Neuronen über die gesamte Neuraxis reagiert, sind im Wesentlichen alle Organe und Gewebe, einschließlich des Gefäßsystems, ohne den charakteristischen und diagnostischen Hz -Ausschlag anfällig für Infektionen und Krankheiten. Tatsächlich wird vorausgesagt, dass 7 Personen für jeden 1 -Fall von HZ mit Ausschlag ohne entsprechende Ausschlag mit VZV reaktivieren.39 Darüber hinaus hat unsere Gruppe gezeigt, dass Einzelpersonen im Speichel bis zu 12 Jahre nach dem Hz immer noch ein aktives Virus abgeben können, was darauf hindeutet, dass mindestens eine Untergruppe von Personen trotz keines Ausschlags eine laufende Replikation aufweist. In dieser Studie hatten 67% der Patienten im Speichel mindestens 3 Monate nach dem Rash noch ein aktives Virus.40 Somit wird die Belastung durch VZV -Erkrankung, insbesondere die Dauer, wahrscheinlich stark unterschätzt.

Hz wird als Schlaganfallrisikofaktor anerkannt; Hz erhöht das Risiko eines Schlaganfalls bis zu 1 Jahr nach dem Hz, wobei das Risiko höher ist, wenn Hz in der Ophthalmologischen Verteilung oder bei Personen <40 Jahre 41 Jahre alt ist Insbesondere die Daten aus 9 Studien in den USA, Europa und Asien zeigen, dass das relative Schlaganfallrisiko nach HZ 1,78 betrug (95% CI 1,70-1,88) Für den ersten Monat nach HZ fällt zunehmend auf 1,20 (95% CI 1,14-1,26). Nach 1 Jahr.41 Das Schlaganfallrisiko stieg im ersten Monat nach einer Hz Ophthalmicus-Episode um eine größere Marge: Relatives Risiko betrug 2,05 (95% CI 1,82-2,31); Und das Schlaganfallrisiko blieb ein Jahr nach der akuten Episode erhöht. 41 Eine kürzlich retrospektive US-amerikanische Studie mit 23.339 Hz-Personen und 46.378 Kontrollpersonen stellte fest, dass Hz-Personen während der 8-wöchigen Gesamtdauer von Hz signifikant häufiger mit einem Schlaganfall unter einem Schlaganfall leiden: angepasste Inzidenzrate-Verhältnisse für alle Patienten und Patienten im Alter von 18 bis 49 Jahren (95% CI, 0,93-2,11) (95% CI, 0,93-2,11)). und 8,12 (95% CI, 0,93-71,27). jeweils (p <0,05); Das Risiko wurde um 1 Jahr zu Grundlinie zurückgekehrt.42 Das erhöhte Schlaganfallrisiko bei Personen mit HZ, die <50 Jahre alt sind, ist im Vergleich zu allen HZ -Personen bemerkenswert, da diese Personen nicht für den HZ -Impfstoff qualifiziert sind.

While the mechanisms underlying VZV and vascular disease are not fully elucidated, histological and immunohistochemical studies of VZV-infected arteries, analysis of cerebrospinal fluid (CSF) from VZV vasculopathy patients for cytokines and matrix metalloproteinases (MMPs), and in vitro studies provide some clues to the pathogenesis of disease (reviewed in Nagel and Bubak, 2018) 10. Insbesondere bei VZV-Reaktivierung wandert Virus entlang von Nervenfasern, die in der äußersten adventitiellen Schicht der Arterie enden, wo virus-infizierte Adventionsfibroblasten während der gesamten Krankheitserkrankung eine robuste Entzündungsreaktion mit Neutrophilen in Krankheiten sowie T-Zellen und Makrophagen hervorrufen. VZV-infizierte Zellen, Neutrophile und andere infiltrierende Immunzellen produzieren aktivierte MMPs, die die extrazelluläre Matrix abbauen, die möglicherweise zu einer Schwächung der Gefäßwand, der Aneurysmabildung und dem Bruch führen. Es wurde auch beschrieben, dass lösliche Faktoren, die von entzündlichen Zellen sekretiert werden, weiter zum Tod und Ansammlung von Myofibroblasten in der verdickten Intima beitragen, was möglicherweise zu einer arteriellen Okklusion führt. Die "löslichen Faktoren" wurden jedoch bis vor kurzem von unserer Gruppe (nachstehend beschrieben) nicht charakterisiert.

Rolle von Exosomen in Krankheitszuständen: Zirkulierende Exosomen haben sich als wichtige "lösliche Faktoren" herausgestellt, die die Zellen beeinflussen können, die von ihrer Herkunftsstelle entfernt sind. Exosomen sind kleine extrazelluläre Vesikel (~ 40-200 nm im Durchmesser) des endosomalen Ursprungs, die Ladung (Proteine, Nukleinsäuren usw.) von ihren Ursprungszellen zu benachbarten oder distalen Zellen für die Kommunikation während normaler und pathologischer Zustände tragen, biologische Prozesse und Reaktion auf Krankheiten.43 regulieren Beispielsweise können Exosomen, die aus Blutplättchen, Megakaryozyten und mononukleären Zellen (PBMCs) stammen In anderen Studien enthalten Exosomen, die aus nasopharyngealen Karzinomzellen freigesetzt werden, die für EBV positiv sind Darüber hinaus stammen Exosomen (und andere extrazelluläre Vesikel) ab:

1. Brustkrebszellen induzieren eine Thrombozytenaktivierung und -aggregation, die zur krebsassoziierten Thrombose beitragen51; Und
2. VZV-infizierte primäre vaskuläre adventitielle Fibroblasten des menschlichen Gehirns vermitteln die Dysfunktion der Endothelzellen und die Übertragung von Virionen.52 Wir haben kürzlich eine Pilotstudie veröffentlicht, die mit pathogenen Plasmaexosomen von Patienten mit akutem Hz prothrombotisch und proinflammatorisch ist.2 veröffentlicht.2 Specific proteins that were significantly elevated in HZ exosomes and involved in the platelet activation, signaling, and aggregation pathways included thrombospondin 1 (THBS1),53,54 caveolae-associated protein 2 (CAVIN-2),55 coagulation factor V (F5),56 and coagulation factor XIII A1 chain (F13A1)57 (Fig. 1). In Hz -Exosomen erhöhte kardiovaskuläre Systemkrankheitsproteine ​​umfassten Calmodulin 1 (Calm1) und Tretenhyretin (TTR) (Abb. 1). Erhöhter Calmodulin 1 kann zu oxidativem Stress im Zusammenhang mit dem Tod neuronaler Zelltod nach hypoxisch-ischämischer Hirnverletzung beitragen und ist ein Prädiktor für schlechte Schlaganfälle.58,59 Obwohl ein erhöhtes Serum -Tranetin mit verbesserten ischämischen Schlaganfallergebnissen in Verbindung gebracht wurde, kann 60 Tretenhyretin auch oligomerisieren und oxidativen Stress, Entzündungen und Zelltoxizität induzieren.61,62 In der Tat sind während Hz amyloidfördernde Faktoren in Plasma vorhanden, wodurch 8 möglicherweise eine Aggregation von erhöhtem zirkulierendem Tretenhyretin zur toxischen oligomeren Form in Arterien verursacht wird, die an die an cerebrale Amyloidangiopathie (CAA) erinnert.

Verbindung zwischen vaskulärer Demenz und VZV: Wie oben beschrieben, wurde gezeigt, dass VZV ein ursächlicher Mittel der oben genannten Risikofaktoren ist (Schlaganfall, Gefäßentzündung usw.). Eine kürzlich durchgeführte epidemiologische Studie aus zwei unabhängigen Datenbanken (Finngen und UKB) ergab, dass die VZV -Reaktivierung das Risiko für die Entwicklung einer vaskulären Demenz signifikant erhöht (2,33 bzw. 6,22; Gefährdungsverhältnisse) .13 Eine Barriere bei der Akzeptanz von VZV und Viren im Allgemeinen zur Entwicklung von vaskulärer Demenz und Alzheimer -Krankheit ist das Fehlen oder inkonsistentes Vorhandensein von Virusantigen/Nukleinsäuren in den erkrankten Geweben zum Zeitpunkt des Todes. Dies kann möglicherweise durch ein "Hit-and-Run" -Phänomen (Virus infiziert Gewebe, verursacht irreversible Schäden, aber anschließend geräumt), aber wir schlagen vor, dass nicht-infektiöse Exosomen, die in der Peripherie (dorsale Wurzel- und Trigeminus-Ganglien) produziert werden, (dorsale Wurzel- und Trigeminus-Ganglien) produziert werden können, die zu einer Distanz von Viral-Replikationen beitragen können. Die Mechanismen, bei denen VZV direkt zur vaskulären Demenzpathologie bei nicht lytischen Infektionen beiträgt, wurde nicht untersucht und steht im Mittelpunkt dieses Vorschlags. Zusammengenommen nehmen wir an, dass zirkulierende Exosomen während Hz und in den folgenden Monaten die Vaskulitis und Thrombose fördern und somit eine mechanistische Grundlage für das erhöhte Risiko für Gefäßstörungen vor der vaskulären Demenz darstellen.

Signifikanz: Starke epidemiologische und korrelative Daten existieren die Verknüpfung von VZV und Demenz, einschließlich Gefäßerkrankungen und Alzheimer-Krankheit.13,15-20 Ein Mangel an mechanistischen Nachweisen hat jedoch zu zögern geführt, die beiden zu kausativ zu verknüpfen. Daher zielt dieser Vorschlag darauf ab, diese Wissenslücke zu beheben, indem die Rolle von pathogenen, lang anhaltenden Exosomen nach HZ bei Gefäßerkrankungen systematisch getestet wird. Mechanistisch aufdecke Proteine/miRNAs von Interesse können möglicherweise die klinische Praxis im Hinblick auf die Dauer der antiviralen Therapie und die Verwendung von Anti-Platten-Wirkstoffen für HZ verändern sowie die Unterstützung für die Impfung erhöhen, um Hautausschlag zu verhindern und den Schlaganfall und das Risiko des vaskulären Demenz zu mildern. Darüber hinaus werden unsere Ergebnisse als Modell dafür dienen, wie andere Krankheitserreger an den Stellen von Regionen der Infektion lang anhaltende Effekte haben können und weitere Forschungen zu den biologischen Folgen von pathogenassoziierten Exosomen stimulieren.

Innovation und Auswirkungen: Dieser Vorschlag hat mehrere Innovationsbereiche. Die Längsscharakterisierung und die mechanistische Untersuchung zirkulierender Exosomen während Hz und 12 Monaten Post wird:

1. ein mechanistisches Verständnis für das epidemiologisch beobachtete erhöhtes Risiko für vaskuläre Demenz und Schlaganfall nach Hz bieten. Die direkten Beiträge von Viren zu Demenz, einschließlich vaskulärer Demenz und Alzheimer -Krankheit, sind immer noch umstritten, da die meisten Daten, die die beiden verbinden, epidemiologisch und korrelativ sind. In diesem Vorschlag erzeugte Daten liefern unvoreingenommene mechanistische Informationen darüber, wie VZV direkt zu Gefäßerkrankungen führen kann, was dringend benötigte ursächliche Hinweise auf einen Risikofaktor im Frühstadium oder das Fehlen davon liefert.
2. Klinisches Management ändern. Derzeit umfassen modifizierbare Risikofaktoren für Schlaganfall und Gefäßerkrankungen Bluthochdruck, Rauchen, Diabetes und Hypercholesterinämie. Da diese pathogenen Exosomen das Risiko für Thrombose und Vaskulitis erhöhen, sollte die Modifikation des Schlaganfallrisikofaktors die Hz-Impfung mit dem nicht lebenden Untereinheiten-Impfstoff (Shingrix) umfassen. Wenn Hz auftritt, kann eine antivirale Therapie längerer Dauer gemäß unseren Ergebnissen erforderlich sein, die die Zeitdauer zeigen, die diese pathogenen Exosomen bestehen, sowie durch Anti-PlaTelet- und entzündungshemmende Wirkstoffe. Wenn verfügbar, kann es auch eine Verwendung für neuartige Therapeutika geben, die Exosomenfreisetzung/Fusion verhindern.
3. Ändern Sie das Paradigma der Infektionskrankheiten. Normalerweise gehen wir davon aus, dass die nachfolgenden Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit vernachlässigbar sind, sobald die klinischen Merkmale eines Infektionsmittels aufgelöst wurden (z. B. Hautausschlag aus der VZV -Reaktivierung). Das Vorhandensein von pathogenen Exosomen, die monatelang zirkulieren, in Abwesenheit des ausgelösten infektiösen Wirkstoffs legt nahe, dass Kliniker die Infektionsgeschichte ab dem Zeitpunkt des Schlaganfalls oder der Präsentation von Gefäßerkrankungen infizieren müssen.
4. Verwenden Sie eine neue, modernste Technologie (Exoview R200), mit der die Sortierung und Charakterisierung einzelner Exosomen uns hilft, die Heterogenität der Bevölkerung zu verstehen. Diese Ergebnisse werden zusammen mit der größeren Ergebnisse der beiden Ziele (einschließlich Exosomen -Sequenzierungsdaten) Daten für zukünftige Zuschüsse liefern, um die Funktion und die Herkunftszellen der Exosomen -Teilmengen aufzuklären.

Studie Begründung AIM 1. Analysieren Sie den Exosomengehalt für bekannte vaskuläre schädliche Proteine/miRNAs aus übereinstimmenden Kontroll- und Hz-Personen über einen Zeitraum von 12 Monaten. Unter Verwendung von Massenspektrometrie und kleinen RNA-Sequenzierung quantifizieren wir Häufigkeit und zeitliche Veränderungen von exosomalen Proteinen und miRNAs, die mit vaskulären Dysfunktion, Entzündung, Koagulation und Schlaganfall assoziiert sind, und korrelieren Sie dann Analyten mit klinischen und laborischen Merkmalen (Anti-VZV-Titern und IgM-Titern und IgM, Complete-Blood-Zahlen). Anreicherungsanalysen werden im Netzwerk exosomaler Proteine ​​und miRNAs durchgeführt, um Wege und gemeinsame Analyten aufzudecken, die mit Hz, Gefäßstörungen und neurodegenerativen Prozessen assoziiert sind.

Begründung: Wir haben kürzlich veröffentlicht, dass Plasma -Exosomen während akuter Hz erhöhte THBS1 und andere Proteine ​​enthalten, die mit vaskulärer Dysfunktion assoziiert sind.2 Die longitudinale Persistenz dieser Risikofaktorproteine ​​ist jedoch nicht bekannt und ist unabdingbar, die Mechanismen aufzudecken, die das Risiko des langfristigen vaskulären Demenzverbots vermitteln und letztendlich auf interventionelle Therapien über antivirale Behandlungen hinaus zielten. Angesichts der epidemiologischen Daten, die die Hz -Reaktivierung korrelieren, und eine Erhöhung der Demenzdiagnose innerhalb von 5 Jahren, 15 und in jüngerer Zeit, die starke Korrelation der Hz -Reaktivierung und des Gefäßdemenzrisikos 13 werden bestimmte Risikofaktorproteine ​​und miRNAs nach der Hz -Reaktivation vorbehalten. Die zeitliche Dynamik der Risikofaktorproteine ​​ist ein kritischer Schritt über akute Zeitpunkte hinaus, da die Personen nach Hautausschlag nicht mehr auf antivirale Therapie stehen, deren Ausdehnung sich als klinisch machbar und kostengünstig erweisen könnte, um das Risiko zu verringern.

AIM 2. Bestimmen Sie die Mechanismus, in denen nicht-infektiöse Hz-Exosomen die vaskuläre Dysfunktion fördern. Plasma exosomes isolated from control and HZ individuals at timepoints above will be applied to human vascular endothelial cells derived from healthy donors or donors with APOE4 allele, then conditioned supernatant analyzed for proinflammatory cytokines (IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13 und TNF-α) durch Multiplex-ELISA. Die Zellen werden auch auf die Erzeugung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und die Amyloidablagerung analysiert. Darüber hinaus werden wir Blutplättchen von gesunden Spendern zur Kontrolle und Hz-Exosomen freisetzen, um die Thrombozytenfunktion durch Quantifizierung von: (1) Thrombozytenaktivierung (Hochregulation von P-Selectin, αiibβ3 und Phosphatidylserin) durch Durchflusszytometrie zu bewerten; (2) Thrombozytenadhäsion und Aggregation in mikrofluidischen Durchflussassays; und (3) Thrombozytenretraktion durch Gerinnselkontraktionstests. Wir werden dann den funktionalen Assay-Ergebnissen mit klinischen und labenden Merkmalen (oben) korrelieren, einschließlich der Entwicklung von Schlaganfall und anderen Gefäßereignissen bei Personen bis 12 Monate nach dem Hz. Knock-Down-Experimente spezifischer Proteine ​​wie Thrombospondin-1 werden durchgeführt, um den Mechanismus der Pathogenese auf molekularer Ebene zu untersuchen.

Begründung: Wir schlagen vor, die pathogenen Wirkungen von Hz -Exosomen auf drei Zelltypen zu untersuchen, die in die vaskuläre Demenz integriert sind, nämlich Gefäßfibroblasten (HBVAFs), vaskuläre Endothelzellen (VECs) und Blutplättchen. Auf diese Weise wollen wir die Mechanismen aufdecken, die dem epidemiologischen Nachweis eines vzV-induzierten erhöhten Risikos einer Gefäßanstrandie zugrunde liegen. Erstens ist bekannt, dass HBVAFs durch die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Zytokinen 76 sowie die Proliferation und Migration der Adventitien während der VZV -Vaskulopathie -Fälle.10 eine Schlüsselrolle bei Gefäßerkrankungen und Dysfunktionen spielen. Unsere vorläufige Studie zeigte, dass HBVAFs, die Hz-Plasma-Exosomen ausgesetzt waren, die bei 3 Monaten nach Hz eingenommen wurden, die Sekretion von IL-6 und IL-8 induzierten, bei denen es sich Die Dauer dieses Effekts, andere Zytokine und die ROS-Produktion wurden jedoch nicht aufgeklärt und könnte eine grundlegende Rolle bei chronischer Gefäßstörung spielen, die bei Personen bis 12 Monate nach dem Hz beobachtet wurden. Zweitens sind VECs auch Schlüsselkomponenten in vaskulären Dysfunktionen, die in Fällen vaskulärer Demenz beobachtet wurden, mit einer Zunahme der ROS-Produktion und der proinflammatorischen Zytokinfreisetzung sowie einer Störung in engen Verbindungen, die die Integrität von Blutbrain-Barrier-Integrität vermitteln. Darüber hinaus besteht das APOE4-Allel, das Personen trägt Daher schlagen wir vor, zu untersuchen, ob die pathogenen Wirkungen von Hz-Exosomen in ApoE4-Tragen von Individuen verschärft werden, indem VECs verglichen werden, die sowohl von einem Träger als auch einem Nichtträger von APOE4 abgeleitet sind. Schließlich ist eine vaskuläre Demenz durch eine Verschlachtung des Blutflusses zum Gehirn gekennzeichnet, wobei bei Patienten die Blutplättchenhyperaktivität beobachtet wird. Unsere frühere Studie ergab, dass Hz-Exosomen während akuter Hz-Thrombozytenaktivierung und Thrombozyten-Leukozyten-Aggregationen induzierten. Die Dauer dieses Effekts ist jedoch unbekannt und wird auf 12 Monate nach dem Hz mit und ohne klinisch verwendete Anti-PlaTelet-Wirkstoffe getestet. Der Befund eines lang anhaltenden Einflusss von Hz-Exosom auf die Thrombozytenaktivierung und die entsprechende Minderung der Wirkung von Anti-PlaSelet-Arzneimitteln könnte eine klinisch machbare therapeutische Intervention darstellen.

Frühere Berichte haben eine entzündungshemmende Rolle für THBS1 in Exosomen beschrieben, wenn sie Makrophagen ausgesetzt sind.78 Unsere Pilotstudie und vorläufige Daten zeigen eine robuste Zunahme von THSB1 bei Exosomen von HZ -Patienten, jedoch nicht kontrolliert.8 Um zu testen, ob die erhöhte Last von THBS1 in Hz -Exosomen für die Erhöhung der Zytokinfreisetzung und die ROS -Produktion verantwortlich ist, werden wir die HBVAF- und VEC -Expositionsexperimente in Gegenwart und Abwesenheit eines THBS1 -Inhibitors LSKL durchführen. Darüber hinaus ist THBS1 ein wirksamer Aktivator von TGFB1 und die Überproduktion von TGFB1 wird bei Alzheimer- und Gefäßerkrankungen beobachtet und induziert zerebrovaskuläre Amyloidose.79-81 Daher wird der THBS1-Inhibitor auch in den Amyloidablagerungsstests verwendet, um die Exosomen-zahlreiche THBS1-vermittelte Amyloidbildung in Gefäßzellen zu bewerten.

Studiendesign Diese Studie ist eine nicht interventionelle/beobachtende Studie, in der Teilnehmerdaten und Biospecimens erfasst werden, um den Exosomengehalt für bekannte Gefäßschaden-Proteine/miRNAs bei HZ-Personen über einen Zeitraum von 12 Monaten (6 Besuche) im Vergleich zur Kontrollgruppe (ein Besuch) zu analysieren.

AIM 1. Analysieren Sie den Exosomengehalt für bekannte vaskuläre schädliche Proteine/miRNAs aus übereinstimmenden Kontroll- und Hz-Personen über einen Zeitraum von 12 Monaten.

Erwartete Ergebnisse und Interpretationen: Auf der Grundlage unserer vorläufigen und veröffentlichten Pilotstudienergebnisse erwarten wir einen signifikanten Anstieg der mit Thrombose und Gefäßerkrankungen ("Risikofaktor-Proteine") einschließlich Thrombose, Cavin-2, F5, F13A1, Calm und Calle1 und Trometin (TTR). Darüber hinaus erwarten wir, dass diese exosomalen Proteine ​​in Hz -Personen während des ersten Besuchs und 7 Tage später auf ähnlichen Niveaus bleiben, weil die Patienten eine antivirale Therapie gewesen wären. Dann erwarten wir nach 1 und 3 Monaten einen Anstieg dieser Proteine ​​in einer Untergruppe von Personen, die immer noch eine anhaltende virale Replikation haben, die lediglich mit antiviralen Zeiten verlangsamt wurde. Diese Personen hätten VZV -IgG -Titer, die seit dem ersten Besuch nicht abgenommen haben (abnehmende VZV -IgG -Titer spiegeln die produktive VZV -Infektion auf, die auf Latenz zurückkehrt), steigender VZV -IgG -Titer seit dem ersten Besuch oder persistenten VZV -IGM oder Conversion von VZV -IgM von negativ bis positiv. Mit anderen Worten, wir gehen davon aus, dass die VZV -IgG -Spiegel diesen Anstiegshöhen in den interessierenden Proteinen entsprechen, die an einer Untergruppe von Hz -Personen von Interesse sind, was auf eine anhaltende Virusreplikation ohne Ausschlag bei bestimmten Patienten hindeutet. In der Tat hat unsere Gruppe zuvor das anhaltende Absatz von VZV im Speichel von 67% der Hz -Personen von 3 Monaten bis 12 Jahren nach HZ ohne Vorhandensein eines Ausschlags gemeldet.56 Daher können die Erhöhungen der exosomalen Risikofaktorproteine ​​bei Hz -Personen auf die unvollständige Abschaltung des Virus zurückzuführen sein. Wir gehen davon aus Angesichts der Tatsache, dass das Schlaganfallrisiko für Personen mit HZO am höchsten ist, erwarten 10 wir erwarten, dass Exosomen von HZO -Personen unter allen HZ -Personen das höchste Niveau an Risikofaktorproteinen aufweisen werden. Wie in unseren vorläufigen Studien vorhergesagt, erwarten wir keine viralen Proteine ​​oder Zytokine in den Exosomen der Kontroll- und Hz -Individuen.

In Bezug auf die RNA -Sequenzierung von Hz -Exosomen erwarten wir keine viralen Transkripte, da VZV -DNA und RNA während Hz selten nachgewiesen werden (Personalkommunikation, Professor Ravi Mahalingam). Wir gehen davon aus Interessanterweise zeigte eine vorläufige Studie in unserem Labor die signifikante Erhöhung dieser miRNAs in Exosomen von VZV-infizierten sensorischen Neuronen im Vergleich zu Exosomen aus mockinfizierten Neuronen (Abb. 2). Schließlich erwarten wir, dass APOE4 Einzelpersonen die robustesten und anhaltendsten Risikofaktorproteine/miRNAs in ihren zirkulierenden Exosomen aufweist, da APOE4 ein bekannter Risikofaktor für vaskuläre Demenz ist.67-69

AIM 2. Bestimmen Sie die Mechanismus, in denen nicht-infektiöse Hz-Exosomen die vaskuläre Dysfunktion fördern.

Erwartete Ergebnisse und Interpretationen: Unsere Pilotzytokinstudien zeigten eine Zunahme der Produktion von IL-6 und IL-8 aus HBVAFs (bei denen es sich um wichtige Regulatoren für Entzündungen und Gefäßwandstruktur und -funktion handelt) nach Exposition gegenüber Hz-Exosomen im Vergleich zu Kontrollen (Abb. 3) .2 .2 .2 .2 .2 .2 .2. Wir gehen davon aus, dass dies bei einer größeren Stichprobengröße weiterhin der Fall sein wird und in den VECs auftritt. Wir nehmen diese Zytokine an, und die ROS-Produktion wird an den Zeitpunkten von 1 und 3 Monaten ihren Höhepunkt erreichen. Für die meisten Personen nehmen wir an, dass die Fähigkeit, Entzündungen zu induzieren, und ROS in naiven Zellen um 12 Monate nach dem Hz verringern. APOE4-Tragen von VECs jedoch wahrscheinlich hyperentzündlich bleiben. Wir haben diesen Assay auch unter Verwendung von Exosomen durchgeführt, die aus mock- oder vZV-infizierten menschlichen sensorischen Neuronen in vitro abgeleitet wurden. Im Vergleich zu Scheinexosomen, die VZV-konditionierte Exosomen (die nicht infektiös sind), die auf naive HBVAFs angewendet werden, erhöhte die Sekretion von IL-6, IL-8 und IL-1 & bgr; signifikant die Sekretion; Daher vermuten wir, dass die Exosomen, die entzündliche Zytokinproduktion auslösen, aus VZV-infizierten Zellen stammen. Angesichts der Tatsache, dass wir eine längere Erhöhung von Hz-Exosomen sehen, die erhöhte Risikofaktorproteine ​​enthalten, und diese Hz-Exosomen können immer noch IL-6 und IL-8 3 Monate nach Hz2 induzieren, legt nahe, dass eine anhaltende Virusreplikation in (einer Untergruppe oder aller) Hz-Patienten nach dem Ausschlag vorliegt. Wie oben erwähnt, zeigte unsere Gruppe ein aktives VZV -Abbau im Speichel von Hz -Patienten bis zu 12 Jahre nach der Clearance von Hautausschlag.40 Wir prognostizieren auch, dass die Amyloidablagerung in Zellen beobachtet werden, die Hz -Exosomen ausgesetzt sind, nicht jedoch Kontrollpersonen, und dass dieser Effekt in den VOE4 -Tragen von VECs am wichtigsten sein wird. Schließlich wird die Immunfluoreszenzfärbung wahrscheinlich eine Verringerung der engen Übergangsfärbung in Hz exponierten VECs zeigen, die auf eine Störung der Integrität von Blut-Hirn-Barrier-Integrität hinweisen. Wir glauben, dass die pathogenen Prozesse teilweise auf die erhöhte Belastung von THBS1 in Hz -Exosomen zurückzuführen sind und dass die Blockierung der Aktivität von thbs1 diese Effekte abschwächen wird.

Basierend auf unserer Pilotstudie erwarten wir eine Erhöhung der Thrombozytenaktivierung, gemessen durch eine Erhöhung der Thrombozyten, die P-Selectin und Phosphatidylserin nach Exposition gegenüber Hz-Exosomen, nicht jedoch nicht kontrollieren, Exosomen exprimieren. Darüber hinaus sagen wir voraus, dass dieses Aktivierungsmuster zum Zeitpunkt des 3-Monats-Zeitpunkts, der auf ein anhaltendes Schlaganfallrisiko hinweist, im Einklang mit epidemiologischen Daten immer noch herausragend sein wird. Die 20% ige Exosomenexposition aus Hz -Proben hat wahrscheinlich ein ausgeprägteres Aktivierungsmuster als 10%. Wir erwarten, dass das Aktivierungsmuster 12 Monate nach HZ vermindert wird und sich nicht wesentlich von Kontrollexosomen unterscheidet. In ähnlicher Weise erwarten wir, dass eine Zunahme der Rate und Menge an Thrombozyten und Fibrinakkumulation in den mikrofluidischen Modellen von Thrombozyten, die Hz -Exosomen ausgesetzt sind, im Vergleich zu Blutplättchen, die Kontrollexosomen ausgesetzt sind, ausgesetzt sind. Wir erwarten, dass der CD36-Inhibitor die Hz-Exosom-induzierten Effekte auf die Thrombozytenfunktion abschwächen wird, was starke mechanistische Beweise liefert. Unter Verwendung mehrerer Methoden zum Testen von Thrombozytenaktivierung, Aggregation und Funktion sowie der Induktion von proinflammatorischen Zytokin, ROS und Amyloidproduktion durch HBVAFs und VECs werden wir bei verschiedenen Zeitpunkten ein umfassendes funktionelles Profil für Hz -Exosomen erzeugen. Die Ergebnisse dieser Studien werden kritische Auswirkungen auf die klinische Praxis haben und wie wir über die VZV -Reaktivierung im Allgemeinen denken. Insbesondere wenn sich gezeigt wird, dass Hz-Exosomen pathologisch aktiv sind und ein funktionelles erhöhtes Risiko für Schlaganfall- und Gefäßfunktionsstörung vermitteln, wie unsere vorläufigen Daten vermuten lassen, werden längere antivirale Behandlung und/oder Anti-Platten-Tatelet-Therapien gerechtfertigt. Schließlich werden wir wahrscheinlich spezifische Proteine ​​in den Exosomen über Massenspektrometrie (in AIM 1) identifizieren, die mit den in AIM 2 vorgeschlagenen funktionellen/mechanistischen Assays korrelieren. Dies könnte weitere therapeutische interventionelle Ziele liefern, und die vorläufige Daten für zukünftige Knock-Down-Experimente, bei denen exosomale Proteine ​​von Interesse blockiert werden, um zu sehen, ob die Aktivierung von Platetten abhängt.