Badanie, które gromadzi dane uczestników i biospecimenów do analizy patogennych egzosomów, które pośredniczą w zwiększonym ryzyku otępienia naczyniowego u osób z półprzestopem. (R01)

Demencja naczyniowa: Demencja naczyniowa jest drugą najczęstszą postacią demencji po chorobie Alzheimera i jest szeroko scharakteryzowana jako utrata dopływu krwi do mózgu i wrzucona bariera krew-mózg (BBB), co ostatecznie prowadzi do zaniku mózgu i upośledzenia poznawczego. są czynnikami i czynnikami ryzyka rozwoju demencji naczyniowej. Niedawno wirusy zostały zidentyfikowane jako potencjalne czynniki ryzyka.

Wirus ospy wietrznej (VZV) i dysfunkcja naczyniowa: VZV jest wyłącznie ludzkim, dwuniciowym DNA alfaherpeswirusem, który wytwarza ospę wietrzną (kurnik), a następnie ustanawia opóźnienie w neuronach sensorycznych i autonomicznych zwojowych neuronach 30-35 w> 95% dorosłych dorosłych w USA. najmniej 1 na 3 osoby do produkcji opryszczki (HZ; gonty) i innych chorób neurologicznych z lub bez wysypki. 38 Pomimo dostępności dwóch szczepionek Hz, ponad 1 milion Amerykanów rozwija się rocznie Mniej znany ogółowi społeczeństwa jest częstotliwość reaktywacji VZV bez wysypki (Herpete Sine Sine). Biorąc pod uwagę, że VZV reaktywuje się z neuronów zwojowych w całej neuraksji, zasadniczo wszystkie narządy i tkanki, w tym naczyniowe, są podatne na zakażenie i choroby bez charakterystycznej i diagnostycznej wysypki HZ. W rzeczywistości przewiduje się, że na każdy 1 przypadek Hz z wysypką 7 osobników reaktywuje się z VZV bez odpowiadającej wysypki. 39 Ponadto nasza grupa wykazała, że ​​jednostki nadal mogą zrzucić aktywnego wirusa w ślinie do 12 lat po HZ, co sugeruje, że przynajmniej podzbiór osób może mieć ciągłą replikację pomimo żadnej wysypki; W tym badaniu 67% pacjentów nadal miało aktywnego wirusa w ślinie co najmniej 3 miesiące po rasie. 40 Zatem ciężar choroby VZV, szczególnie czas trwania, prawdopodobnie nie doceniono.

Hz jest rozpoznawany jako czynnik ryzyka udaru; Hz zwiększa ryzyko udaru do 1 roku po HZ, przy czym ryzyko jest wyższe, gdy HZ występuje w rozmieszczeniu okulistycznym lub u osób w wieku <40 lat. W szczególności dane zbiorcze z 9 badań w USA, Europie i Azji pokazują, że względne ryzyko udaru po HZ wyniosło 1,78 (95% CI 1,70-1,88) W pierwszym miesiącu następującym po HZ spadając stopniowo do 1,20 (95% CI 1,14-1.26) po 1 roku 41 Ryzyko udaru mózgu wzrosło o większy margines w pierwszym miesiącu po odcinku Hz Ofithalmicus: Ryzyko względne wyniosło 2,05 (95% CI 1,82-2,31); A ryzyko udaru pozostało podwyższone rok po ostrym epizodzie. 41 Ostatnie badanie retrospektywne w USA 23 339 osób Hz i 46 378 kontroli, badacze stwierdzili, że podczas 8-tygodniowego okresu agregatu osoby Hz znacznie częściej miały udarzenie: skorygowany wskaźnik częstości występowania dla wszystkich pacjentów i pacjentów w wieku od 18 do 49 lat wynosiły 1,40 (95% CI, 0,93-2,11) i 8,12 (95% CI, 0,93-71,27), odpowiednio (p <0,05); Ryzyko powróciło do linii bazowej do 1 roku 42 Zwiększone ryzyko udaru u osób z HZ, które mają <50 lat, w porównaniu do wszystkich osób HZ, jest niezwykłe, ponieważ osoby te nie kwalifikują się do szczepionki HZ.

Podczas gdy mechanizmy leżące u podstaw choroby VZV i choroby naczyniowej nie są w pełni wyjaśnione, badania histologiczne i immunohistochemiczne tętnic zakażonych VZV, analiza płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) od pacjentów z naczyniami VZV (recenzja w Nagakinach i MATRIX, Metaloproteinaza (MMPS) i in vitro zapewniają pewne przychylenie choroby (recenzja w Nagak, NAGAK, i MATAK, 2018) 10. W szczególności, po reaktywacji VZV, wirus podróżuje wzdłuż włókien nerwowych, które kończą się w najbardziej zewnętrznej warstwie przygodowej tętnicy, w której zakażone wirusem fibroblasty wywołują solidną odpowiedź zapalną obejmującą neutrofile wcześnie w chorobie, oraz komórki T i makrofagi przez cały okres choroby. Komórki zakażone VZV, neutrofile i inne infiltrujące komórki odpornościowe wytwarzają aktywowane MMP, które degradują matrycę pozakomórkową potencjalnie prowadzącą do osłabienia ściany naczynia, tworzenia się tętniaka i pęknięcia. Opisano również rozpuszczalne czynniki wydzielane przez komórki zapalne w celu dalszego przyczynienia się do śmierci mięśni gładkich naczyń i akumulacji miofibroblastów w pogrubionej intymie, potencjalnie prowadząc do okluzji tętnic. Jednak „czynniki rozpuszczalne” nie zostały do ​​niedawna scharakteryzowane przez naszą grupę (opisaną poniżej).

Rola egzosomów w stanach chorobowych: Krążące egzosomy pojawiły się jako ważne „rozpuszczalne czynniki”, które mogą wpływać na komórki odległe z ich miejsca pochodzenia. Egzosomy to małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (o średnicy ~ 40-200 nm) pochodzenia endosomalnego, które niosą ładunek (białka, kwasy nukleinowe itp.) Od ich komórek pochodzenia do sąsiednich lub dystalnych komórek komunikacyjnych w stanach normalnych i patologicznych, regulując procesy biologiczne i odpowiedź na chorobę.43.43. Na przykład egzosomy pochodzące z płytek krwi, megakariocytów i jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) mogą przenosić CXCR4 i CCR5 do komórek, które nie mają tych receptorów, zwiększając w ten sposób liczbę podatnych komórek do zakażenia HIV. 44,45. 44,45 W innych badaniach egzosomy uwalniane z komórek raka nosogardzieli dodatnie dla EBV zawierają wirusowe utajone białko błony 1 i inne czynniki wirusowe/komórkowe, które manipulują mikrośrodkiem nowotworów w celu zwiększenia postępu guza i ulegania odpowiedzi immunologicznej na komórki nowotworowe. 46-505050. Ponadto egzosomy (i inne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe) pochodzące z:

1. Komórki raka piersi indukują aktywację i agregację płytek krwi, przyczyniając się do zakrzepicy związanej z rakiem 51; I
2. Zakażone VZV pierwotne ludzkie mózg naczyniowe Fibroblasty przygodowe pośredniczą w dysfunkcji komórek śródbłonka i przenoszeniu wirionów. 52 Niedawno opublikowaliśmy badanie pilotażowe wykazujące patogenne egzosomy w osoczu od pacjentów z ostrym HZ są protothbotic i prozapalne 2 Specyficzne białka, które były znacząco podwyższone w egzosomach HZ i zaangażowane w szlaki aktywacji płytki krwi, sygnalizację i agregację, obejmowały trombospondynę 1 (THBS1), 53,54 białko 2 (F13A1) 57 (ryc. 2), 55 czynnik koagulacji V (F5), 56 i czynnik koagulacji XIII A1). Białka choroby układu sercowo -naczyniowego podwyższone w egzosomach HZ obejmowały kalmodulinę 1 (Calm1) i przeztrentynę (TTR) (ryc. 1). Podwyższona kalmodulina 1 może przyczynić się do stresu oksydacyjnego związanego ze śmiercią komórek nerwowych po uszkodzeniu mózgu niedotlenienie-izchemicznym i jest predyktorem słabych wyników udaru mózgu. 58,59 Chociaż zwiększona transthryretina w surowicy była związana z ulepszonymi wynikami udaru niedokrwiennego, 60 transtrytyny może również oligomeryzować i indukować stres oksydacyjny, zapalenie i toksyczność komórek. 61,62 Rzeczywiście, podczas HZ czynniki produkujące amyloidy występują w osoczu, 8 potencjalnie powodujących agregację zwiększonej krążącej transthytretyny do toksycznej oligomerycznej postaci w tętnicach przypominających mózgową angiopatię amyloidową (CAA).

Związek między otępieniem naczyniowym a VZV: Jak opisano powyżej, wykazano, że VZV jest czynnikiem sprawczym wyżej wymienionych czynników ryzyka (udar, zapalenie naczyniowe itp.). Ponadto ostatnie badanie epidemiologiczne z dwóch niezależnych baz danych (Finngen i UKB) wykazały, że reaktywacja VZV znacznie zwiększa ryzyko rozwoju demencji naczyniowej (odpowiednio 2,33 i 6,22; stosunki ryzyka) .13 Barierą w akceptacji VZV i wirusów ogólnie w rozwoju otępienia naczyniowego i choroby Alzheimera jest brak lub niespójna obecność wirusowego antygenu/kwasów nukleinowych w chorych tkankach w chwili śmierci. Chociaż można to potencjalnie wytłumaczyć zjawiskiem „hit-and-i-run” (wirus infekuje tkanki, powoduje nieodwracalne uszkodzenie, ale następnie jest oczyszczone), proponujemy, aby egzosomy nieinfekcyjne wytworzone na peryferiach (korzeń grzbietowa i zwoju trygeminacji) mogą przyczynić się do odległości choroby. Mechanizmy, w których VZV bezpośrednio przyczynia się do patologii demencji naczyniowej przy braku infekcji litycznej, nie zostały zbadane i są przedmiotem tej propozycji. Podsumowując, hipotezujemy, że krążące egzosomy podczas HZ i w kolejnych miesiącach będą promować zapalenie naczyń i zakrzepicę, zapewniając w ten sposób mechanistyczną podstawę dla zwiększonego ryzyka dysfunkcji naczyniowej poprzedzających otępienie naczyniowe.

Znaczenie: Istnieją silne dane epidemiologiczne i korelacyjne łączenie VZV i otępienie, w tym choroby naczyniowe i choroby Alzheimera. 13,15-20 Jednak niedostatek dowodów mechanistycznych spowodowało wahanie się przyczynowego powiązania tych dwóch. Zatem ta propozycja ma na celu rozwiązanie tej luki w wiedzy poprzez systematyczne testowanie roli patogennych, długotrwałych egzosomów po HZ w procesach chorób naczyniowych. Mechanistycznie odkrywające białka/miRNA interesujące mogą potencjalnie zmienić praktykę kliniczną w odniesieniu do czasu trwania terapii przeciwwirusowej i zastosowania środków przeciwplateletowych dla HZ, a także zwiększyć wsparcie szczepienia w celu zapobiegania wysypce i ograniczaniu ryzyka udaru mózgu i naczyniowego. Ponadto nasze odkrycia będą służyć jako model tego, w jaki sposób inne patogeny mogą mieć długotrwałe efekty w miejscach odległych od obszarów zakażenia i stymulować dalsze badania nad biologicznymi konsekwencjami egzosomów związanych z patogenem.

Innowacje i wpływ: ta propozycja ma kilka obszarów innowacji. Charakterystyka wzdłużna i mechaniczne badanie krążących egzosomów podczas HZ i 12 miesięcy po:

1. Zapewnij mechanistyczne zrozumienie obserwowanej epidemiologicznie zwiększone ryzyko demencji naczyniowej i udaru mózgu po HZ. Bezpośredni udział wirusów w demencję, w tym otępienie naczyniowe i chorobę Alzheimera, jest nadal kontrowersyjny, biorąc pod uwagę większość danych łączących dwa są epidemiologiczne i korelacyjne. Dane wygenerowane w niniejszej propozycji dostarczą obiektywnych mechanistycznych informacji na temat tego, w jaki sposób VZV może bezpośrednio prowadzić do choroby naczyniowej, przyczyniając się do bardzo potrzebnych dowodów sprawczych czynnika ryzyka lub jego braku.
2. Zmień zarządzanie kliniczne. Obecnie modyfikowalne czynniki ryzyka udaru mózgu i choroby naczyniowej obejmują nadciśnienie, palenie, cukrzycę i hipercholesterolemiię. Ponieważ te patogenne egzosomy zwiększają ryzyko zakrzepicy i zapalenia naczyń, modyfikacja czynnika ryzyka udaru powinna obejmować szczepienie HZ szczepionką przeciw podjednostce (Shingrix). Jeśli wystąpi HZ, terapia przeciwwirusowa o dłuższym czasie trwania może być uzasadniona, jak określono w naszych wynikach pokazujących, że czas trwają te patogenne egzosomy, a także środki przeciwplatowe i przeciwzapalne. Jeśli to możliwe, może być również zastosowane w nowatorskich terapeutycznych, które zapobiegają uwalnianiu/fuzji egzosomu.
3. Zmień paradygmat chorób zakaźnych. Zazwyczaj zakładamy, że po ustąpieniu cechy klinicznej środka zakaźnego (takie jak wysypka z reaktywacji VZV), jego późniejszy wpływ na zdrowie ludzkie jest znikomy. Obecność patogennych egzosomów krążących przez miesiące przy braku wyzwalania środka zakaźnego sugeruje, że klinicyści muszą rozważyć odległość historii zakaźnej od czasu udaru mózgu lub choroby naczyniowej.
4. Zastosuj nową, najnowocześniejszą technologię (Exoview R200), która umożliwi sortowanie i charakterystykę pojedynczych egzosomów, aby pomóc nam zrozumieć heterogeniczność populacji. Wyniki te, wraz z większą liczbą wyników z 2 celów (w tym danych sekwencjonowania egzosomu), dostarczy danych dla przyszłych dotacji w celu wyjaśnienia funkcji i komórek pochodzenia podzbiorów egzosomu.

Badanie uzasadnienia AIM 1. Analizuj zawartość egzosomów dla znanych białek uszkadzających naczyń/miRNA od dopasowanych osób kontrolnych i HZ w okresie 12 miesięcy. Za pomocą spektrometrii mas i małego sekwencjonowania RNA będziemy określić ilościowo liczebność i czasowe zmiany białek egzosomalnych i miRNA związanych z dysfunkcją naczyniową, zapaleniem, koagulacją i udarem, a następnie koreluje anality z cechami klinicznymi i laboratoryjnymi (Anti-VZV IgG i IgG, kompletne liczby krwi, kompotencyjną panel metaboliczny oraz APTT/PT/INR). Analizy wzbogacania będą przeprowadzane w sieci białek egzosomalnych i miRNA w celu odkrycia szlaków i wspólnych analitów związanych z HZ, dysfunkcją naczyniową i procesami neurodegeneracyjnymi.

Uzasadnienie: Niedawno opublikowaliśmy, że podczas ostrego HZ egzosomy w osoczu zawierają podwyższone Thbs1 i inne białka związane z dysfunkcją naczyniową 2 Jednak podłużna trwałość tych białek czynników ryzyka nie jest znana i jest niezbędna do odkrycia mechanizmów pośredniczących w długoterminowym ryzyku otępienia naczyniowego i ostatecznie ukierunkowanych terapii interwencyjnych poza leczeniem przeciwwirusowym. Biorąc pod uwagę dane epidemiologiczne korelujące reaktywację HZ i wzrost diagnozy demencji w ciągu 5 lat, 15 i niedawno, silna korelacja reaktywacji HZ i ryzyka otępienia naczyniowego, 13 przewidujemy, że niektóre białka czynnika ryzyka i miRNA pozostaną podwyższone przez rok po reaktywacji HZ. Czasowa dynamika białek czynnika ryzyka jest kluczowym krokiem poza ostre punkty czasowe, ponieważ zazwyczaj po zezwoleniu na wysypkę nie są już terapii przeciwwirusowej, której przedłużenie może okazać się klinicznie wykonalnym i opłacalnym sposobem zmniejszenia ryzyka.

AIM 2. Określ mechanizm (y), w których nieinfekcyjne egzosomy HZ promują dysfunkcję naczyniową. Egzosomy w osoczu izolowane z osobników kontrolnych i HZ w punktach czasowych powyżej będą stosowane do ludzkich naczyniowych komórek śródbłonka pochodzących od zdrowych dawców lub dawców allelu APOE4, a następnie uwarunkowane supernatanty analizowane pod kątem cytokin prozapalnych (IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12P70, IL-1β, IL-2-2, IL-4, IL-8, IL-100, IL-12P70, IL-12P70, IL-110, IL-100, IL-110, IL-100, IL-100, IL-100, IL-100, IL-100, IL-10, IL-13 i TNF-α) przez multipleks ELISA. Komórki będą również analizowane pod kątem generowania reaktywnych form tlenu (ROS) i odkładania się amyloidu. Ponadto narazimy płytki krwi zdrowych dawców na kontrolę i egzosomy HZ, aby ocenić funkcję płytek krwi przez kwantyfikację: (1) aktywację płytek krwi (regulacja w górę P-selektyny, αIIBβ3 i fosfatydyloseryny) za pomocą cytometrii przepływowej; (2) adhezja i agregacja płytek krwi w testach przepływu mikroprzepływowego; oraz (3) cofanie płytek za pomocą testów skurczu skrzepu. Następnie korelujemy wyniki testu funkcjonalnego z cechami klinicznymi i laboratoryjnymi (powyżej), w tym rozwojem udaru mózgu i innych zdarzeń naczyniowych u osób do 12 miesięcy po HZ. Zostaną przeprowadzone eksperymenty z powaleniem określonych białek, takich jak trombospondin-1 w celu zbadania mechanizmu patogenezy na poziomie molekularnym.

Uzasadnienie: Proponujemy zbadanie patogennego wpływu egzosomów HZ na trzy typy komórek zintegrowane z otępieniem naczyniowym, mianowicie naczyniowe fibroblasty naczyniowe (HBVAF), naczyniowe komórki śródbłonka (VEC) i płytki krwi. W ten sposób staramy się odkryć mechanizmy leżące u podstaw epidemiologicznych dowodów indukowanych przez VZV podwyższonego ryzyka otępienia naczyniowego. Po pierwsze, wiadomo, że HBVAF odgrywają kluczową rolę w chorobie naczyniowej i dysfunkcji, poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS) i cytokin, 76, a także proliferacji i migracji przygody podczas przypadków naczyńczopatii VZV.10 Nasze wstępne badanie wykazało, że HBVAF narażone na egzosomy w osoczu HZ pobierane na 3 miesiące po HZ indukowały wydzielanie IL-6 i IL-8, które są kluczowymi regulatorami zapalenia i struktury i funkcji ściany naczyniowej, w porównaniu z kontrolnymi egzozomami w osoczu. Jednak czas trwania tego efektu, inne cytokiny i produkcja ROS nie została wyjaśniona i mogła odgrywać fundamentalną rolę w przewlekłej dysfunkcji naczyniowej obserwowanej u osób do 12 miesięcy po HZ. Po drugie, VEC są również kluczowymi składnikami dysfunkcji naczyniowych obserwowanych w przypadkach otępienia naczyniowego, ze wzrostem produkcji ROS i prozapalnym uwalnianiem cytokin, a także zakłóceniem w ciasnych połączeniach pośredniczących integralności bariery krew-mózg. Ponadto allel APOE4 przewożący osobniki są na podwyższonym ryzyku rozwoju otępienia naczyniowego, 67-69, ponieważ VEC wyrażające APOE4 wykazują podwyższony stan prozapalny i protzbonowy w porównaniu z innymi izoformami ApoE. 77 Dlatego proponujemy zbadanie, czy patogenne działanie egzosomów HZ są zaostrzone w osobach przewożących APOE4, porównując VEC pochodzące zarówno z nośnika, jak i nie-kariery APOE4. Wreszcie, otępienie naczyniowe charakteryzuje się niedrożnością przepływu krwi do mózgu, z nadpobudliwością płytek u pacjentów. Nasze poprzednie badanie ujawniło, że egzosomy HZ podczas ostrej indukowały aktywację płytek krwi i agregacji płytek krwi i płomiennych. Jednak czas trwania tego efektu jest nieznany i zostanie przetestowany do 12 miesięcy po HZ, z klinicznie stosowanymi klinicznie środkami przeciwplateletowymi. Odkrycie długotrwałego wpływu egzosomu HZ na aktywację płytek krwi i odpowiadające mu ograniczające działanie leków przeciwplateletowych może stanowić klinicznie wykonalną interwencję terapeutyczną.

Poprzednie raporty opisały roli prozapalną dla THBS1 w egzosomach, gdy są narażone na makrofagi. 78 Nasze badanie pilotażowe i wstępne dane pokazują silny wzrost THSB1 w egzosomach pacjentów z HZ, ale nie kontroluje. 8 Dlatego, aby sprawdzić, czy podwyższone obciążenie THBS1 w egzosomach HZ jest odpowiedzialne za wzrost uwalniania cytokin i produkcji ROS, przeprowadzimy eksperymenty ekspozycji HBVAF i VEC w obecności i braku inhibitora THBS1, LSKL. Ponadto Thbs1 jest silnym aktywatorem TGFB1, a nadprodukcję TGFB1 obserwuje się w chorobie Alzheimera i naczyniowej i indukuje amyloidozę naczyniowo-naczyniową. 79-81 Dlatego inhibitor THBS1 zostanie również zastosowany w testach odkładania amyloidu w celu oceny niszczenia egzosomu, tworzenia amyloidu za pośrednictwem Thbs1 w komórkach naczyniowych.

Projekt badania To badanie jest badaniem nieinterwencjonalnym/obserwacyjnym, które zbiera dane uczestników i biospecimenów w celu analizy zawartości egzosomu dla znanych białek/miRNA naczyniowych u osób HZ w okresie 12 miesięcy (6 wizyt) w porównaniu z grupą kontrolną (jedna wizyta).

AIM 1. Analizuj zawartość egzosomu dla znanych białek uszkadzających naczyń/miRNA z dopasowanych osób kontrolnych i HZ w okresie 12 miesięcy.

Oczekiwane wyniki i interpretacje: Na podstawie naszych wstępnych i opublikowanych wyników badań pilotażowych spodziewamy się zmierzyć znaczny wzrost białek egzosomu związanych z zakrzepicą i chorobą naczyniową („białka czynnika ryzyka”), w tym THBS1, Cavin-2, F5, F13A1, Calm1 i nadtytretyny (TTR) w egzosomach w podciągu w podciągarze uzyskanym z a ostrej wizyty) w porównaniu z kontrolą. Ponadto oczekujemy, że te egzosomalne białka u osób HZ pozostaną na podobnych poziomach podczas pierwszej wizyty, a 7 dni później, ponieważ pacjenci byliby w leczeniu przeciwwirusowym; Następnie po 1 i 3 miesiącach oczekujemy wzrostu tych białek w podzbiorze osób, które nadal mają ciągłą replikację wirusową, która była jedynie spowolniona z lekiem przeciwwirusowym; Osoby te miałyby miana VZV IgG, które nie zmniejszyły się od początkowej wizyty (zmniejszenie mian IgG VZV odzwierciedlają produktywne rozwiązywanie infekcji VZV i powrót wirusa do opóźnienia), rosnące miana IgG VZV od początkowej wizyty, lub uporczywy VZV IgM IgM lub zbieżność VZV IgM od negatywnego do pozytywnego. Innymi słowy, przewidujemy, że poziomy VZV IgG będą odpowiadały tym wysokościom w białkach będących przedmiotem zainteresowania podzbioru osób HZ, co sugeruje bieżącą replikację wirusową bez wysypki u niektórych pacjentów. Rzeczywiście, nasza grupa wcześniej zgłosiła uporczywe zrzucanie VZV w ślinie 67% osób HZ z 3 miesięcy do 12 lat po HZ bez obecności wysypki 56 Zatem podniesienia białek czynnika ryzyka egzosomalnego u osób HZ może być spowodowane niepełnym wyłączeniem wirusa. Oczekujemy, że te białka czynnika ryzyka osiągną szczyt po około 3 miesiącach po HZ, a następnie spadają po 6- i 12 miesiącach po HZ, ponieważ badanie jednostek naczyńców VZV wykazało, że średni czas od Hz do udaru wynosi około 4 miesięcy. 57.57 Dodatkowo, biorąc pod uwagę, że ryzyko udaru jest najwyższe dla osób z HZO, 10 oczekujemy egzosomów od osób HZO będzie miało najwyższy poziom białek czynników ryzyka wśród wszystkich osób HZ. Jak przewidywano w naszych wstępnych badaniach, nie oczekujemy, że białka lub cytokiny w egzosomach kontroli i HZ.

W odniesieniu do sekwencjonowania egzosomów HZ RNA nie oczekujemy żadnych wirusowych transkryptów, ponieważ DNA i RNA VZV są rzadko wykrywane podczas HZ (komunikacja osobista, profesor Ravi Mahalingam). Oczekujemy, że wykryjemy zmiany w miRNA zaangażowanych w choroby mózgowe i sercowo-naczyniowe, takie jak miR-221 i miR-222, które są podwyższone u osób z chorobą naczyniową, 73 miR-143, która jest ważnym mediatorem nadciśnienia tętniczego płuc, 74 i miR-31, które zwiększają stres oksydacyjny w komórkach mięśni gładkich naczyniowych. 75. Co ciekawe, wstępne badanie w naszym laboratorium wykazało znaczne podniesienie tych miRNA w egzosomach neuronów czuciowych zakażonych VZV w porównaniu z egzosomami z próbnych neuronów zakażonych (ryc. 2). Wreszcie spodziewamy się, że APOE4 przewożące osoby będą miały najbardziej solidne i trwałe białka/miRNA czynnika ryzyka w ich krążących egzosomach, biorąc pod uwagę APOE4, jest znanym czynnikiem ryzyka demencji naczyniowej. 67-69

AIM 2. Określ mechanizm (y), w których nieinfekcyjne egzosomy HZ promują dysfunkcję naczyniową.

Przewidywane wyniki i interpretacje: Nasze pilotażowe badania cytokin wykazały wzrost produkcji IL-6 i IL-8 z HBVAF (które są kluczowymi regulatorami stanu zapalnego i struktury i funkcji ściany naczyniowej) po ekspozycji na egzosomy HZ w porównaniu do kontroli (ryc. 3) .2 .2 Przewidujemy, że będzie tak było w przypadku większej wielkości próby i wystąpią w VEC. Postawiamy hipotezę tych cytokin, a produkcja ROS osiągnie szczyt w 1- i 3-miesięcznych punktach czasowych. W przypadku większości osób postawiamy hipotezę zdolności do indukowania stanu zapalnego, a ROS w naiwnych komórkach zmniejszy się o 12 miesięcy po HZ, jednak APOE4 przewożący VEC prawdopodobnie pozostanie hiper-zapalny. Przeprowadziliśmy również ten test przy użyciu egzosomów pochodzących z pozornych lub zakażonych przez VZV neuronów czuciowych in vitro. W porównaniu z próbnymi egzosomami egzosomy warunkowane przez VZV (które są nieinfekcyjne) zastosowały się do naiwnych HBVAF znacznie zwiększone wydzielanie IL-6, IL-8 i IL-1β; Dlatego podejrzewamy, że egzosomy, które wyzwalają produkcję cytokin zapalnych, pochodzą z komórek zakażonych VZV. Biorąc pod uwagę, że widzimy przedłużone podwyższenie egzosomów HZ zawierających podwyższone białka czynnika ryzyka i te egzosomy HZ mogą nadal indukować IL-6 i IL-8 po 3 miesiącach po HZ2 sugeruje, że u pacjentów z wysypką lub wszystkich) u pacjentów z wysypką. Jak wspomniano powyżej, nasza grupa wykazała aktywne zrzucanie VZV w ślinie pacjentów z HZ do 12 lat po złożeniu wysypki. 40 Przewidujemy również, że obserwujemy odkładanie amyloidu w komórkach narażonych na egzosomy HZ, ale nie kontroluje i że efekt ten będzie najbardziej widoczny w VEC przewożących APOE4. Wreszcie, barwienie immunofluorescencyjne prawdopodobnie wykazuje zmniejszenie barwienia ciasnego połączenia w HZ narażonych VEC, co wskazuje na zakłócenie integralności bariery krew-mózg. Uważamy, że procesy patogenne są częściowo należne z podwyższonym obciążeniem THBS1 w egzosomach HZ i że blokowanie aktywności THBS1 osłabia te efekty.

Na podstawie naszego badania pilotażowego 2 przewidujemy wzrost aktywacji płytek krwi, mierzonych przez wzrost liczby płytek krwi wyrażających selektynę p i fosfatydyloserynę po ekspozycji na egzosomy HZ, ale nie egzosomy kontrolne. Ponadto przewidujemy, że ten wzór aktywacji będzie nadal widoczny w 3-miesięcznym punkcie czasowym wskazującym na trwałe ryzyko udaru, zgodnie z danymi epidemiologicznymi; 20% ekspozycja egzosomu z próbek HZ może mieć bardziej wyraźny wzór aktywacji niż 10%. Oczekujemy, że wzorzec aktywacji po 12 miesiącach po HZ zostanie zmniejszony i nie różni się znacząco od egzosomów kontrolnych. Podobnie spodziewamy się wzrostu szybkości i liczby akumulacji płytek krwi i fibryny w modelach mikroprzepływowych płytek krwi narażonych na egzosomy HZ w porównaniu z płytkami krwi narażonymi na egzosomy kontrolne. Oczekujemy, że inhibitor CD36 osłabi wpływ indukowanego egzosomem HZ na funkcję płytek krwi, co dostarczy silnych dowodów mechanistycznych. Korzystając z wielu metodologii do testowania aktywacji płytek krwi, agregacji i funkcji, a także indukcji prozapalnej cytokiny, ROS i amyloidu przez HBVAF i VEC, wygenerujemy kompleksowy profil funkcjonalny dla egzosomów HZ w różnych punktach czasowych. Wyniki tych badań będą miały kluczowe implikacje dla praktyki klinicznej i tego, jak myślimy o reaktywacji VZV w ogóle. W szczególności, jeśli wykazano, że egzosomy HZ są patologicznie aktywne i zapewniają funkcjonalne zwiększone ryzyko udaru mózgu i dysfunkcji naczyniowej, jak sugerują nasze wstępne dane, wówczas uzasadnione są dłuższe leczenie przeciwwirusowe i/lub terapie przeciwplateletowe. Wreszcie, prawdopodobne jest, że zidentyfikujemy określone białka w egzosomach za pomocą spektrometrii masowej (w AIM 1), które będą korelować z testami funkcjonalnymi/mechanistycznymi zaproponowanymi w AIM 2. Może to zapewnić dalsze cele interwencyjne terapeutyczne i dane wstępne dla przyszłych eksperymentów z powaleniem, w których egzosomalne interesujące białka interesujące są zablokowane, aby zobaczyć, czy aktywność płytki płata są stłumione.