Uno studio che raccoglie dati dei partecipanti e biospecimen per analizzare esosomi patogeni che mediano un aumento del rischio di demenza vascolare negli individui con herpes zoster. (R01)

Demenza vascolare: la demenza vascolare è la seconda forma più comune di demenza dopo la malattia di Alzheimer ed è caratterizzata ampiamente come una perdita di approvvigionamento di sangue al cervello e compromesso la barriera emato-encefalica (BBB) ​​che porta a piastrelone cerebrale (impianti cerebrali (infartazioni cerebrali (infartazioni cerebrali (infartazioni cerebrali) Contributori e fattori di rischio per lo sviluppo della demenza vascolare. Recentemente i virus sono stati identificati come potenziali fattori di rischio.

Varicella Zoster Virus (VZV) e disfunzione vascolare: VZV è un alfaherpesus di DNA esclusivamente umano, a doppio filamento che produce varicella (vaccinaio) quindi la latenza all'interno di neuroni sensoriali e autonomi Ganlionici 30-35 in> 95% di adulti negli Stati Uniti. 1 individui su 3 per produrre herpes zoster (Hz; tegole) e altre malattie neurologiche con o senza eruzione cutanea.38 Nonostante la disponibilità di due vaccini Hz, oltre 1 milione di americani sviluppano Hz ogni anno.9 Meno noto al pubblico è la frequenza della riattivazione di VZV senza eruzione cutanea (Zoster Sine Herpete). Dato che VZV riattiva dai neuroni ganglionici durante l'intera neuraxis, essenzialmente tutti gli organi e i tessuti, compresa la vascolarizzazione, sono soggetti a infezione e malattia senza la cutanea caratteristica e diagnostica di Hz. In effetti, si prevede che per ogni 1 caso di HZ con eruzione cutanea, 7 individui riattiveranno con VZV senza un'eruzione cutanea corrispondente.39 Inoltre, il nostro gruppo ha dimostrato che gli individui possono ancora perdere virus attivo nella loro saliva fino a 12 anni dopo Hz, suggerendo che almeno un sottoinsieme di individui può avere una replica in corso nonostante nessuna eruzione cutanea; In questo studio il 67% dei pazienti aveva ancora un virus attivo nella loro saliva almeno 3 mesi dopo la rash.40 Pertanto, l'onere della malattia di VZV, in particolare la durata, è probabilmente gravemente sottovalutato.

HZ è riconosciuto come un fattore di rischio di ictus; HZ aumenta il rischio di ictus fino a 1 anno dopo Hz, con un rischio più alto quando Hz si verifica nella distribuzione oftalmica o negli individui <40 anni di età.41 In particolare, i dati raccolti da 9 studi negli Stati Uniti, in Europa e in Asia mostrano che il rischio relativo di ictus dopo HZ era di 1,78 (IC 95% 1,70-1,88) Per il primo mese successivo a HZ, scendendo progressivamente a 1,20 (IC 95% 1,14-1,26) Dopo 1 anno.41 Il rischio di ictus è aumentato di un margine maggiore durante il primo mese dopo un episodio di Ophthalmicus Hz: il rischio relativo era di 2,05 (IC 95% 1,82-2,31); E il rischio di ictus è rimasto elevato un anno dopo l'episodio acuto. 41 Un recente studio retrospettivo degli Stati Uniti su 23.339 individui Hz e 46.378 controlli, gli investigatori hanno scoperto che durante il periodo aggregato di 8 settimane, gli individui HZ avevano significativamente più probabilità di subire un ictus: rapporti di incidenza adeguati per tutti i pazienti e i pazienti di età compresa tra 18 e 49 anni erano 1,40 (IC 95%, 0,93-2.11) e 8,12 (IC al 95%, 0,93-71,27), rispettivamente (p <0,05); Rischio restituito al basale di 1 anno.42 L'aumento del rischio di ictus in soggetti con Hz che hanno <50 anni, rispetto a tutti gli individui HZ, è notevole perché questi individui non si qualificano per il vaccino HZ.

While the mechanisms underlying VZV and vascular disease are not fully elucidated, histological and immunohistochemical studies of VZV-infected arteries, analysis of cerebrospinal fluid (CSF) from VZV vasculopathy patients for cytokines and matrix metalloproteinases (MMPs), and in vitro studies provide some clues to the pathogenesis of disease (reviewed in Nagel and BUBAK, 2018) 10. In particolare, dopo la riattivazione di VZV, il virus si trasferisce lungo le fibre nervose che terminano nello strato avventato più esterno dell'arteria in cui i fibroblasti avventiziali infetti dal virus suscitano una solida risposta infiammatoria che coinvolge neutrofili precoci nelle malattie e le cellule T per tutto il corso della malattia. Le cellule infette da VZV, i neutrofili e altre cellule immunitarie infiltranti producono MMP attivati, che degradano la matrice extracellulare che potenzialmente portano all'indebolimento della parete del vaso, alla formazione di aneurisma e alla rottura. Sono stati anche descritti fattori solubili secreti dalle cellule infiammatorie per contribuire ulteriormente alla morte del muscolo liscio vascolare e all'accumulo di miofibroblasti nell'intima ispessita, portando potenzialmente all'occlusione arteriosa. Tuttavia, i "fattori solubili" non sono stati caratterizzati fino a poco tempo fa dal nostro gruppo (descritto di seguito).

Ruolo degli esosomi negli stati patologici: esosomi circolanti sono emersi come importanti "fattori solubili" che possono influenzare le cellule remote dal loro sito di origine. Gli esosomi sono piccole vescicole extracellulari (~ 40-200 nm di diametro) di origine endosomiale che trasportano carico (proteine, acidi nucleici, ecc.) Dalle loro cellule di origine alle cellule adiacenti o distale per la comunicazione durante gli stati normali e patologici, regolando i processi biologici e la risposta alla malattia.43 Ad esempio, gli esosomi derivati ​​da piastrine, megacarieociti e cellule mononucleate periferiche del sangue (PBMC) possono trasferire CXCR4 e CCR5 in cellule che non hanno questi recettori, aumentando così il numero di cellule sensibili per l'infezione da HIV.44.45 In altri studi, gli esosomi rilasciati dalle cellule di carcinoma rinofaringeo positive per EBV contengono la proteina di membrana latente virale 1 e altri fattori virali/cellulari che manipolano il microambiente tumorale per migliorare la progressione del tumore e alleviare le risposte immunitarie alle cellule tumorali.46-50 Inoltre, esosomi (e altre vescicole extracellulari) derivate da:

1. Le cellule del carcinoma mammario inducono l'attivazione e l'aggregazione piastrinica, contribuendo alla trombosi associata al cancro51; E
2. I fibroblasti avvenziali vascolari cerebrali umani primari infetti da VZV mediano la disfunzione delle cellule endoteliali e la trasmissione dei virioni.52 Abbiamo recentemente pubblicato uno studio pilota che mostra esosomi plasmatici patogeni da pazienti con Hz acuto sono protrombotici e proinfiammatori.2 Le proteine ​​specifiche che erano significativamente elevate negli esosomi Hz e coinvolti nelle vie di attivazione, segnalazione e aggregazione piastrinica includevano la trombospondina 1 (THBS1), 53,54 Proteina 2 (Fig. 1). Le proteine ​​della malattia del sistema cardiovascolare elevate negli esosomi Hz includevano la calmodulina 1 (calmo1) e la transiretina (TTR) (Fig. 1). L'elevata calmodulina 1 può contribuire allo stress ossidativo associato alla morte delle cellule neurali dopo lesioni cerebrali ipossiche-ischemiche ed è un predittore di scarsi esiti dell'ictus.58,59 Sebbene un aumento della trantiretina sierica sia stata associata a risultati di ictus ischemico migliorato, 60 trantiretina può anche oligomerizzare e indurre stress ossidativo, infiammazione e tossicità cellulare.61,62 Infatti, durante l'Hz, nel plasma sono presenti fattori di promozione dell'amiloide, 8 potenzialmente causando l'aggregazione dell'aumento della tranhiretina circolante alla forma oligomerica tossica nelle arterie che ricordano l'angiopatia amiloide cerebrale (CAA).

Collegamento tra demenza vascolare e VZV: come descritto sopra, VZV ha dimostrato di essere un agente causale dei suddetti fattori di rischio (ictus, infiammazione vascolare, ecc.). Inoltre, un recente studio epidemiologico di due database indipendenti (FinnGen e UKB) ha riscontrato che la riattivazione di VZV aumenta significativamente il rischio di sviluppare la demenza vascolare in particolare (rispettivamente 2,33 e 6,22; rapporti di pericolo) .13 .13 .13 .13 .13 .13 .13 .13 .13 .13 .13 .13 .13 .13 .13 .13. Una barriera nell'accettazione di VZV e virus in generale allo sviluppo della demenza vascolare e della malattia di Alzheimer è la mancanza o la presenza incoerente di antigene virus/acidi nucleici nei tessuti malati al momento della morte. Sebbene ciò possa essere potenzialmente spiegato da un fenomeno "hit-and-run" (virus infetta i tessuti, provoca danni irreversibili ma successivamente viene cancellato), proponiamo che gli esosomi non infettivi prodotti nella periferia (radice dorsale e gangli trigeminali) possano contribuire alla malattia distante dalla replica virale. I meccanismi in cui VZV contribuisce direttamente alla patologia della demenza vascolare in assenza di un'infezione litica non sono stati studiati ed è al centro di questa proposta. Nel loro insieme, ipotizziamo che gli esosomi circolanti durante l'Hz e nei mesi successivi promuovano la vasculite e la trombosi, fornendo così una base meccanicistica per l'aumento del rischio di disfunzione vascolare che precede la demenza vascolare.

Significato: esistono forti dati epidemiologici e correlazionali che collegano VZV e demenza, tra cui la malattia vascolare e la malattia di Alzheimer.13,15-20 Tuttavia, una scarsità di prove meccanicistiche ha comportato l'esitazione a collegare causalmente i due. Pertanto, questa proposta mira a colmare questo divario nella conoscenza testando sistematicamente il ruolo degli esosomi patogeni e di lunga durata a seguito di HZ sui processi di malattia vascolare. Scoprire meccanicamente proteine/miRNA di interesse può potenzialmente cambiare la pratica clinica per quanto riguarda la durata della terapia antivirale e l'uso di agenti anti-piastrinici per Hz, nonché aumentare il supporto per la vaccinazione per prevenire il rischio di cutanei e mitigare l'ictus e la demenza vascolare. Inoltre, i nostri risultati fungeranno da modello per come altri agenti patogeni possono avere effetti di lunga durata nei siti remoti dalle regioni di infezione e stimolare ulteriori ricerche sulle conseguenze biologiche degli esosomi associati ai patogeni.

Innovazione e impatto: questa proposta ha diverse aree di innovazione. La caratterizzazione longitudinale e l'indagine meccanicistica degli esosomi circolanti durante HZ e 12 mesi dopo:

1. Fornire una comprensione meccanicistica all'epidemiologicamente aumentato il rischio di demenza vascolare e ictus a seguito di HZ. I contributi diretti dei virus alla demenza, tra cui la demenza vascolare e la malattia di Alzheimer, sono ancora controversi, dato che la maggior parte dei dati che collegano i due sono epidemiologici e correlazionali. I dati generati in questa proposta forniranno informazioni meccanicistiche imparziali su come VZV può portare direttamente a malattie vascolari, contribuendo con l'evidenza causale tanto necessaria di un fattore di rischio in fase iniziale o la sua mancanza.
2. Cambia gestione clinica. Attualmente, i fattori di rischio di ictus modificabile e malattie vascolari includono ipertensione, fumo, diabete e ipercolesterolemia. Poiché questi esosomi patogeni aumentano il rischio di trombosi e vasculite, la modifica del fattore di rischio di ictus dovrebbe includere la vaccinazione HZ con il vaccino contro la subunità non Live (shingrix). Se si verifica HZ, la terapia antivirale a durata più lunga può essere giustificata come determinato dai nostri risultati che mostrano il periodo di tempo che questi esosomi patogeni persistono, nonché agenti anti-piastrine e antidiammatori. Se disponibile, potrebbe esserci anche un uso per nuove terapeutiche che impediscono il rilascio/fusione di esosoma.
3. Cambia il paradigma della malattia infettiva. In genere, supponiamo che una volta che le caratteristiche cliniche di un agente infettivo si siano risolte (come l'eruzione cutanea dalla riattivazione di VZV), il suo successivo impatto sulla salute umana è trascurabile. La presenza di esosomi patogeni che circolano per mesi in assenza dell'agente infettivo suggerisce che i medici devono considerare la storia infettiva remota dal momento dell'ictus o della presentazione delle malattie vascolari.
4. Impiega una nuova tecnologia all'avanguardia (Exoview R200) ​​che consentirà l'ordinamento e la caratterizzazione di singoli esosomi per aiutarci a comprendere l'eterogeneità della popolazione. Questi risultati, insieme al corpus più ampio di risultati dei 2 obiettivi (compresi i dati di sequenziamento dell'esosoma), forniranno dati per le sovvenzioni future per chiarire la funzione e le cellule di origine dei sottoinsiemi esosoma.

Studio Razionale AIM 1. Analizzare il contenuto di esosoma per proteine/miRNA dannose vascolari note dal controllo abbinato e individui HZ per un periodo di 12 mesi. Usando la spettrometria di massa e il piccolo sequenziamento dell'RNA, quantificheremo l'abbondanza e i cambiamenti temporali delle proteine ​​esosomiali e dei miRNA associati a disfunzione vascolare, infiammazione, coagulazione e ictus, quindi correlare analiti con caratteristiche cliniche e di laboratorio (i titoli IgG anti-VZV). Verranno condotte analisi di arricchimento sulla rete di proteine ​​esosomiali e miRNA per scoprire percorsi e analiti condivisi associati a HZ, disfunzione vascolare e processi neurodegenerativi.

Razionale: abbiamo recentemente pubblicato che durante la HZ acuta, gli esosomi plasmatici contengono THBS1 elevati e altre proteine ​​associate alla disfunzione vascolare.2 Tuttavia, la persistenza longitudinale di queste proteine ​​del fattore di rischio non è nota ed è indispensabile per scoprire i meccanismi che mediano il rischio di demenza vascolare a lungo termine e alla fine mirano a terapie interventistiche oltre i trattamenti antivirali. Dati i dati epidemiologici che correvano la riattivazione di Hz e un aumento della diagnosi di demenza entro 5 anni, 15 e più recentemente, la forte correlazione della riattivazione di Hz e del rischio di demenza vascolare, 13 prevediamo che alcune proteine ​​del fattore di rischio e miRNA rimarranno elevati per un anno dopo la riattivazione di HZ. Le dinamiche temporali delle proteine ​​del fattore di rischio sono un passo fondamentale oltre i timepoint acuti perché, in genere, a seguito di clearance eruttive non sono più in terapia antivirale, la cui estensione potrebbe rivelarsi un modo clinicamente fattibile ed economico per ridurre il rischio.

Obiettivo 2. Determinare i meccanismi in cui gli esosomi HZ non infettivi promuovono la disfunzione vascolare. Gli esosomi plasmatici isolati dal controllo e gli individui Hz in punti di tempo sopra saranno applicati alle cellule endoteliali vascolari umane derivate da donatori sani o donatori con allele APOE4, quindi surnatante condizionato analizzato per citochine proinfiammatorie (IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-10, TNF-α) di ELISA multiplex. Le cellule verranno anche analizzate per la generazione di specie di ossigeno reattivo (ROS) e la deposizione di amiloide. Inoltre, esporremo piastrine da donatori sani al controllo e agli esosomi Hz per valutare la funzione piastrinica mediante quantificazione di: (1) attivazione piastrinica (upregolazione della P-selectina, αIIBβ3 e fosfatidilserina) mediante citometria a flusso; (2) adesione piastrinica e aggregazione nei test di flusso microfluidico; e (3) retrazione piastrinica mediante saggi di contrazione del coagulo. Correreremo quindi i risultati del test funzionale con le caratteristiche cliniche e di laboratorio (sopra), incluso lo sviluppo di ictus e altri eventi vascolari negli individui fino a 12 mesi dopo la Hz. Verranno condotti esperimenti abbattuti di proteine ​​specifiche come la trombospondina-1 per studiare il meccanismo di patogenesi a livello molecolare.

Razionale: proponiamo di studiare gli effetti patogeni degli esosomi HZ su tre tipi di cellule integrali alla demenza vascolare, vale a dire fibroblasti avventiziali vascolari cerebrali (HBVAF), cellule endoteliali vascolari (VEC) e piastrine. In tal modo, miriamo a scoprire i meccanismi alla base delle prove epidemiologiche di un elevato rischio indotto da VZV di demenza vascolare. In primo luogo, è noto che gli HBVAF svolgono un ruolo chiave nelle malattie vascolari e nella disfunzione, attraverso la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e citochine, 76, nonché proliferazione e migrazione dell'avvenzia durante i casi di vasculopatia VZV.10 Il nostro studio preliminare ha dimostrato che gli HBVAF esposti agli esosomi plasmatici Hz presi a 3 mesi post-Hz hanno indotto la secrezione di IL-6 e IL-8, che sono regolatori chiave dell'infiammazione e della struttura e della funzione della parete vascolare, rispetto agli esosomi plasmatici di controllo.2 Tuttavia, la durata di questo effetto, altre citochine e la produzione di ROS non sono state chiarite e potrebbero svolgere un ruolo fondamentale nella disfunzione vascolare cronica osservata negli individui fino a 12 mesi dopo la Hz. In secondo luogo, i VEC sono anche componenti chiave nella disfunzione vascolare osservata nei casi di demenza vascolare, con un aumento della produzione di ROS e del rilascio di citochine proinfiammatorie, nonché un'interruzione delle giunzioni strette che mediano l'integrità del emato-encefalica. Inoltre, gli alleli APOE4 che trasportano gli individui hanno un elevato rischio di sviluppare la demenza vascolare, 67-69 mentre ApoE4 che esprimono VEC presentano uno stato proinfiammatorio e protrombotico elevato rispetto ad altre isoforme apoe.77 Pertanto, proponiamo di studiare se gli effetti patogeni degli esosomi HZ sono esacerbati negli individui che trasportano APOE4, confrontando i VEC derivati ​​sia da un vettore che da non trasporto di APOE4. Infine, la demenza vascolare è caratterizzata da un'occlusione del flusso sanguigno nel cervello, con iperattività piastrinica osservata nei pazienti. Il nostro precedente studio ha rivelato che gli esosomi HZ durante l'attivazione piastrinica acuta HZ hanno indotto l'attivazione piastrinica e le aggregazioni piastriniche-leukociti. Tuttavia, la durata di questo effetto è sconosciuta e sarà testata a 12 mesi dopo Hz, con e senza agenti anti-platelet clinicamente usati. La scoperta di un impatto duraturo dell'esosoma Hz sull'attivazione piastrinica e sull'effetto mitigante corrispondente dei farmaci anti-piastrince potrebbe rappresentare un intervento terapeutico clinicamente fattibile.

Rapporti precedenti hanno descritto un ruolo pro-infiammatorio per THBS1 negli esosomi quando esposti a macrofagi.78 Il nostro studio pilota e i dati preliminari mostrano un solido aumento di THSB1 negli esosomi di pazienti con Hz ma non controlli.8 Pertanto, per verificare se il carico elevato di THBS1 negli esosomi HZ è responsabile dell'aumento del rilascio di citochine e della produzione di ROS, condurremo gli esperimenti di esposizione HBVAF e VEC in presenza e assenza di un inibitore di THBS1, LSKL. Inoltre, THBS1 è un potente attivatore di TGFB1 e la sovrapproduzione di TGFB1 è osservata nelle malattie di Alzheimer e vascolare e induce amiloidosi cerebrovascolare.79-81 Pertanto, l'inibitore di THBS1 verrà utilizzato anche nei test di deposizione di amiloide per valutare la formazione di amiloide mediata da esosoma, mediata da THBS1 nelle cellule vascolari.

Progettazione dello studio Questo studio è uno studio non intervenzionale/osservazionale che raccoglie dati dei partecipanti e biospecimen al fine di analizzare il contenuto di esosomi per le proteine/miRNA danneggianti vascolari noti negli individui HZ per un periodo di 12 mesi (6 visite) rispetto al gruppo di controllo (una visita).

Obiettivo 1. Analizzare il contenuto di esosoma per proteine/miRNA danneggianti vascolari noti dal controllo abbinato e individui HZ per un periodo di 12 mesi.

Anticipated results and interpretations: Based on our preliminary and published pilot study results, we expect to measure a significant increase in exosome proteins associated with thrombosis and vascular disease ("risk factor proteins") including THBS1, CAVIN-2, F5, F13A1, CALM1, and transthyretin (TTR) in plasma exosomes obtained from acute HZ individuals (initial visit) compared to those obtained from controls. Inoltre, prevediamo che queste proteine ​​esosomiali negli individui HZ rimangano a livelli simili durante la visita iniziale e 7 giorni dopo perché i pazienti sarebbero stati in terapia antivirale; Quindi a 1 e 3 mesi, ci aspettiamo un aumento di queste proteine ​​in un sottoinsieme di individui che hanno ancora una replicazione virale in corso che è stata semplicemente rallentata con gli antivirali; Questi individui avrebbero titoli IgG VZV che non diminuivano dalla visita iniziale (diminuendo i titoli di IgG VZV riflettono la risoluzione produttiva dell'infezione da VZV e il virus che ritorna alla latenza), aumentando i titoli di IgG VZV dalla visita iniziale o una persistente IGM VZV o conversione di VZV IgM da negativo a positivo. In altre parole, prevediamo che i livelli di IgG VZV corrisponderanno a questi aumenti delle proteine ​​di interesse in un sottoinsieme di individui HZ, suggerendo una replicazione virale in corso senza eruzione cutanea in alcuni pazienti. In effetti, il nostro gruppo ha precedentemente riportato lo spargimento persistente di VZV nella saliva del 67% degli individui HZ da 3 mesi a 12 anni dopo Hz senza la presenza di un'eruzione cutanea.56 Pertanto, gli aumenti delle proteine ​​del fattore di rischio esosomiale negli individui HZ possono essere dovuti all'arresto incompleto del virus. Ci aspettiamo che queste proteine ​​del fattore di rischio raggiungano il picco a circa 3 mesi dopo Hz, quindi diminuiscono a 6 e 12 mesi dopo Hz perché uno studio sugli individui di vasculopatia VZV ha mostrato che il tempo medio da Hz all'ictus è di circa 4 mesi.57 Inoltre, dato che il rischio di ictus è più alto per le persone con HZO, 10 ci aspettiamo che gli esosomi da parte degli individui HZO avranno il più alto livello di proteine ​​del fattore di rischio tra tutte le persone HZ. Come previsto nei nostri studi preliminari, non ci aspettiamo di trovare proteine ​​virali o citochine negli esosomi del controllo e degli individui HZ.

Per quanto riguarda il sequenziamento dell'RNA degli esosomi HZ, non ci aspettiamo di vedere trascrizioni virali perché il DNA VZV e l'RNA vengono rilevati raramente durante HZ (comunicazioni personali, il professor Ravi Mahalingam). Ci aspettiamo di rilevare alterazioni nei miRNA implicati nelle malattie cerebro e cardiovascolari come miR-221 e miR-222 che sono elevate negli individui con malattia vascolare, 73 miR-143 che è un importante mediatore dell'ipertensione arteriosa polmonare, 74 e miR-31 che aumenta lo stress ossidativo nelle cellule muscolari vascolari.75 È interessante notare che uno studio preliminare nel nostro laboratorio ha mostrato l'elevazione significativa di questi miRNA negli esosomi di neuroni sensoriali infetti da VZV rispetto agli esosomi da neuroni infetti finti (Fig. 2). Infine, prevediamo che APOE4 che trasportano individui abbiano le proteine/miRNA del fattore di rischio più robuste e persistenti nei loro esosomi circolanti dati apoE4 è un fattore di rischio noto per la demenza vascolare.67-69

Obiettivo 2. Determinare i meccanismi in cui gli esosomi HZ non infettivi promuovono la disfunzione vascolare.

Risultati e interpretazioni previste: i nostri studi di citochine pilota hanno mostrato un aumento della produzione di IL-6 e IL-8 da HBVAFS (che sono regolatori chiave dell'infiammazione e della struttura e della funzione della parete vascolare) a seguito dell'esposizione agli esosomi Hz rispetto ai controlli (Fig. 3). Prevediamo che questo continuerà a essere il caso con una dimensione del campione maggiore e si verificherà nei VEC. Ipotizziamo queste citochine e la produzione di ROS raggiungerà il picco ai timepoint di 1 e 3 mesi. Per la maggior parte degli individui, ipotizziamo la capacità di indurre infiammazione e ROS nelle cellule ingenui diminuiranno di 12 mesi dopo Hz, tuttavia, ApoE4 che trasportano VEC probabilmente rimarrà iper-infiammatoria. Abbiamo anche condotto questo test usando esosomi derivati ​​da neuroni sensoriali umani infetti da finti o VZV in vitro. Rispetto agli esosomi finti, gli esosomi climatizzati con VZV (che non sono infettivi) applicati a HBVAF ingenui aumentavano significativamente la secrezione di IL-6, IL-8 e IL-1β; Pertanto, sospettiamo che gli esosomi che innescano la produzione infiammatoria delle citochine provengano da cellule infette da VZV. Dato che vediamo un elevazione prolungata di esosomi HZ contenenti elevate proteine ​​del fattore di rischio e questi esosomi HZ possono ancora indurre IL-6 e IL-8 a 3 mesi dopo HZ2 suggerisce che vi è una replicazione virale in corso in (un sottoinsieme o tutti) pazienti con HZ dopo che l'eruzione si è liberata. Come notato sopra, il nostro gruppo ha mostrato uno spargimento attivo VZV nella saliva dei pazienti HZ fino a 12 anni dopo l'autorizzazione dell'eruzione.40 Prevediamo anche di osservare la deposizione di amiloide nelle cellule esposte agli esosomi HZ ma non ai controlli e che questo effetto sarà più importante negli APOE4 che trasportano VEC. Infine, la colorazione immunofluorescente mostrerà probabilmente una riduzione della colorazione a giunzione a stretto giunzione in VEC esposti a Hz indicativi di un'interruzione dell'integrità del nastro emato-encefalico. Riteniamo che i processi patogeni siano dovuti, in parte, al carico elevato di THBS1 negli esosomi Hz e che il blocco dell'attività di THBS1 attenuerà questi effetti.

Sulla base del nostro studio pilota, 2 prevediamo di vedere un aumento dell'attivazione piastrinica misurata da un aumento delle piastrine che esprimono p-selectina e fosfatidilserina a seguito di esposizione agli esosomi HZ ma non a controllo degli esosomi. Inoltre, prevediamo che questo modello di attivazione sarà ancora prominente nel punto temporale di 3 mesi indicativo di un rischio prolungato di ictus, coerentemente con i dati epidemiologici; È probabile che l'esposizione all'esosoma del 20% dai campioni di Hz abbia un modello di attivazione più pronunciato del 10%. Prevediamo che il modello di attivazione a 12 mesi dopo HZ sarà ridotto e non significativamente diverso dagli esosomi di controllo. Allo stesso modo, prevediamo di vedere un aumento della velocità e della quantità di accumulo di piastrine e fibrina nei modelli microfluidici di piastrine esposte a esosomi Hz rispetto alle piastrine esposte agli esosomi di controllo. Prevediamo che l'inibitore del CD36 attenua gli effetti indotti dall'esosoma HZ sulla funzione piastrinica, che forniranno forti prove meccanicistiche. Utilizzando più metodologie per testare l'attivazione piastrinica, l'aggregazione e la funzione, nonché l'induzione di citochine proinfiammatorie, ROS e produzione di amiloidi da parte di HBVAF e VECS, genereremo un profilo funzionale completo per gli esosomi HZ in vari tempi in tutta la malattia. I risultati di questi studi avranno implicazioni critiche per la pratica clinica e come pensiamo alla riattivazione di VZV in generale. In particolare, se gli esosomi Hz si dimostrano patologicamente attivi e conferiranno un rischio funzionale aumentato di ictus e disfunzione vascolare, come suggeriscono i nostri dati preliminari, sono garantiti un trattamento antivirale più lungo e/o terapie anti-piastrine. Infine, è probabile che identificheremo proteine ​​specifiche negli esosomi tramite spettrometria di massa (in AIM 1) che correggeranno con i test funzionali/meccanicistici proposti in AIM 2. Ciò potrebbe fornire ulteriori obiettivi interventistici terapeutici e i dati preliminari per i futuri esperimenti di abbattimento in cui le proteine ​​esosomiali di interesse sono bloccate per vedere l'attivazione di piastrini.