Mikrobiomstudie zur funktionellen Dyspepsie

Mikrobiomanalyse

Von jedem Probanden werden Stuhlproben und 8 Schleimhautbiopsien (absteigender Zwölffingerdarm) entnommen. Die Proben werden gemäß Standardlabortechniken verarbeitet und die DNA isoliert.16S Die rDNA-Sequenzanalyse mikrobieller Gemeinschaften in Patientenproben wird mithilfe unserer HiSeq 1500-Schnelllauftechnologien analysiert. Wir führen eine 2 x 150 bp Paired-End-Sequenzierung durch, die eine außergewöhnliche Abdeckung bietet (Lesungen > 30.000). Wir werden die V4-Region der 16s-RNA (E. coli 515-806) sequenzieren, was derzeit die für Illumina HiSeq 1500 optimierte Methode ist. Außerdem werden wir gleichzeitig die V3-Region der 16s-RNA sequenzieren, um eine Dual-Control-Analyse der Proben zu ermöglichen. Gegebenenfalls wird eine bestätigende PCR eingesetzt. Die Daten werden als Gesamtzahl für jede identifizierte Bakterienart gemeldet.

Entzündungszelldichte

Zur Bestimmung der Eosinophilendichte werden routinemäßige histologische Objektträger verwendet, die zuvor mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt wurden.

IHC-Techniken werden zur Bestimmung der Mastzelldichte eingesetzt. Serielle 3-μm-Paraffinschnitte werden luftgetrocknet und auf Objektträgern hitzefixiert. Die Schnitte werden mit Xylol und Jod entparaffiniert und in einer abgestuften Reihe von Alkohol rehydriert. Unter Verwendung des monoklonalen Tryptase-antihumanen Mastzell-Tryptase-Antikörpers der Maus (Klon AA1, Dako, Carpinteria, CA) werden die Schnitte auf einem automatisierten Dako Autostainer 3400 unter Verwendung des LSAB+-Kits von Dako mit an Meerrettichperoxidase konjugiertem Streptavidin gefärbt.

Um die Dichte für jeden Zelltyp zu bestimmen, wird die gesamte Probe gescannt, um den subjektiven Bereich mit der größten Beteiligung zu bestimmen. Die Dichte wird durch Zählen der Zellen innerhalb von 5 aufeinanderfolgenden Hochleistungsfeldern (400-fache Vergrößerung) bestimmt. Es werden die maximale und mittlere Zelldichte, ausgedrückt als Zellen/hpf, bestimmt. Dies wird vor Studienende abgeschlossen sein.

Immunhistochemie (IHC)

Es wird eine IHC-Färbung durchgeführt und kann je nach den Ergebnissen einer laufenden Pilotstudie DCLK1, BDNF, TRPV1 bzw. CRH-R1 umfassen. Die Färbungsintensität wird von einem Pathologen blind ausgewertet, um Punkte für die durchschnittliche IHC-Signalintensität (d. h. 0 = keine, 1 = leicht, 2 = mäßig und 3 = stark) sowie der Prozentsatz der Gewebezellen oder Fasern, die eine positive Immunreaktivität zeigen. Es wird ein semi-quantitatives Bewertungssystem angewendet, bei dem der endgültige immunreaktive Wert dem Produkt aus dem Prozentsatz positiver Zellen mal der durchschnittlichen Färbeintensität entspricht. Der Prozentsatz positiver Zellen oder Fasern wird wie folgt bewertet: 0 = negativ – 10 %, 1 = 11–33 %, 2 = 33–66 % und 3 = > 67 %. Die Immunreaktivität gilt als positiv, wenn der kombinierte Wert zwischen 2 und 6 liegt, und als negativ bei einem Wert von 0 bis 1. Andere IHC-Färbungen können durchgeführt werden, wenn sie gemäß den Angaben in der Literatur relevant werden. Dies wird vor Studienende durchgeführt.

T-Scores für den BASC werden im Rahmen dieser Studie auf dem Datenerfassungsformular erfasst.

Diese Informationen werden verwendet, um psychosoziale Informationen des Patienten zu bewerten. Diese werden vor Studienende gesammelt und aufgezeichnet.