Исследование микробиома функциональной диспепсии

Анализ микробиома

Образцы кала и 8 биопсий слизистой оболочки (нисходящей двенадцатиперстной кишки) будут получены от каждого субъекта. Образцы будут обработаны, а ДНК выделена в соответствии со стандартными лабораторными методами.16S Анализ последовательности рДНК микробных сообществ в образцах пациентов будет проводиться с использованием наших технологий быстрого анализа HiSeq 1500. Мы выполним парное секвенирование концов 2 X 150 п.н., что даст исключительный охват (чтения> 30 000). Мы будем секвенировать область V4 16s РНК (E. coli 515-806), которая в настоящее время является методом, оптимизированным для Illumina HiSeq 1500. Мы также будем одновременно секвенировать область V3 16s РНК, чтобы обеспечить анализ образцов с двойным контролем. При необходимости будет использоваться подтверждающая ПЦР. Данные будут представлены как общее количество для каждого идентифицированного вида бактерий.

Плотность воспалительных клеток

Обычные гистологические препараты, предварительно окрашенные гематоксилином и эозином, будут использоваться для определения плотности эозинофилов.

Методы ИГХ будут использоваться для определения плотности тучных клеток. Серийные парафиновые срезы толщиной 3 мкм будут высушены на воздухе и термофиксированы на предметных стеклах. Срезы будут депарафинизированы ксилолом и йодом и повторно гидратированы в последовательном спирте. Используя моноклональные мышиные антитела к триптазе тучных клеток триптазы (клон AA1, Dako, Carpinteria, CA), срезы будут окрашивать на автоматическом приборе Dako Autostainer 3400 с использованием набора Dako LSAB+ со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена.

Чтобы определить плотность для каждого типа клеток, весь образец будет просканирован, чтобы определить субъективную область наибольшего вовлечения. Плотность будет определяться путем подсчета клеток в пределах 5 последовательных полей высокой мощности (400-кратное увеличение). Определяют пиковую и среднюю плотность клеток, выраженную в виде клеток/очищающих полосок. Это будет завершено до окончания учебы.

Иммуногистохимия (ИГХ)

Будет выполнено окрашивание IHC, которое может включать DCLK1, BDNF, TRPV1 и/или CRH-R1 соответственно, в зависимости от результатов продолжающегося пилотного исследования. Интенсивность окрашивания будет оцениваться патологом слепым методом для присвоения баллов средней интенсивности сигнала IHC (т.е. 0 = нет, 1 = легкая, 2 = умеренная и 3 = сильная), а также процент тканевых клеток или волокон, демонстрирующих положительную иммунореактивность. Будет применяться полуколичественная система оценки, в которой окончательная оценка иммунореактивности будет равна произведению процента положительных клеток на среднюю интенсивность окрашивания. Процент положительных клеток или волокон оценивается следующим образом: 0 = отрицательные — 10 %, 1 = 11–33 %, 2 = 33–66 % и 3 = > 67 %. Иммунореактивность будет считаться положительной, когда совокупный балл находится в диапазоне от 2 до 6, и отрицательной при оценке 0-1. Другие окрашивания IHC могут быть выполнены, если они станут актуальными, как указано в литературе. Это будет выполнено до окончания исследования.

Т-баллы для BASC будут собраны в рамках этого исследования в Форме сбора данных.

Эта информация используется для оценки психосоциальной информации от пациента. Она будет собрана и записана до окончания исследования.