Estudio del Microbioma de Dispepsia Funcional

Análisis de Microbioma

Se obtendrán muestras fecales y 8 biopsias mucosas (duodeno descendente) de cada sujeto. Las muestras se procesarán y el ADN se aislará según las técnicas estándar de laboratorio.16S El análisis de secuencias de ADNr de comunidades microbianas dentro de muestras de pacientes se analizará utilizando nuestras tecnologías de ejecución rápida HiSeq 1500. Realizaremos una secuenciación final emparejada de 2 x 150 pb que brindará una cobertura excepcional (lecturas > 30 000). Secuenciaremos la región V4 del ARN 16s (E. coli 515-806), que es el método optimizado para Illumina HiSeq 1500 actualmente. También secuenciaremos simultáneamente la región V3 del ARN 16s para proporcionar un análisis de muestras de control dual. Se empleará PCR de confirmación cuando sea apropiado. Los datos se informarán como recuentos totales para cada especie bacteriana identificada.

Densidad de células inflamatorias

Se utilizarán portaobjetos de histología de rutina previamente teñidos con hematoxilina y eosina para determinar la densidad de eosinófilos.

Se utilizarán técnicas IHC para la determinación de la densidad de mastocitos. Las secciones de parafina seriadas de 3 μm se secarán al aire y se fijarán con calor en los portaobjetos. Los cortes se desparafinarán con xileno y yodo y se rehidratarán en una serie graduada de alcohol. Utilizando el anticuerpo triptasa monoclonal de ratón antimastocito humano triptasa (clon AA1, Dako, Carpinteria, CA), las secciones se tiñerán en un Dako Autostainer 3400 automatizado utilizando el kit LSAB+ de Dako con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante.

Para determinar la densidad de cada tipo de célula, se escaneará la muestra completa para determinar el área subjetiva de mayor participación. La densidad se determinará contando las células dentro de 5 campos de alta potencia consecutivos (aumento de 400X). Se determinarán las densidades celulares máxima y media expresadas como células/hpf. Esto se completará antes de que finalice el estudio.

Inmunohistoquímica (IHC)

Se realizará tinción IHC y puede incluir DCLK1, BDNF, TRPV1 y/o CRH-R1, respectivamente, según los resultados de un estudio piloto en curso. La intensidad de la tinción será evaluada de forma ciega por un patólogo para asignar puntajes para la intensidad de señal IHC promedio (es decir, 0= ninguno, 1= leve, 2= moderado y 3= fuerte) así como el porcentaje de células tisulares o fibras que muestran inmunorreactividad positiva. Se aplicará un sistema de puntuación sem-cuantitativo en el que la puntuación inmunorreactiva final será igual al producto del porcentaje de células positivas por la intensidad de tinción media. El porcentaje de células o fibras positivas se calificará de la siguiente manera: 0= negativo-10 %, 1= 11-33 %, 2= 33-66 % y 3= > 67 %. Se considerará inmunoreactividad positiva cuando la puntuación combinada oscile entre 2-6 y negativa con una puntuación de 0-1. Se pueden realizar otras tinciones IHC si se vuelven relevantes según lo indicado por la literatura. Esto se realizará antes de finalizar el estudio.

Los puntajes T para el BASC se recopilarán como parte de este estudio en el Formulario de recopilación de datos.

Esta información se utiliza para evaluar la información psicosocial del paciente. Se recopilará y registrará antes de que finalice el estudio.