Studio del microbioma sulla dispepsia funzionale

Analisi del microbioma

Da ciascun soggetto verranno prelevati campioni fecali e 8 biopsie della mucosa (duodeno discendente). I campioni saranno processati e il DNA isolato secondo le tecniche di laboratorio standard.16S L'analisi della sequenza di rDNA delle comunità microbiche all'interno dei campioni dei pazienti sarà analizzata utilizzando le nostre tecnologie di esecuzione rapida HiSeq 1500. Eseguiremo 2 X 150 bp paired end sequencing che forniranno una copertura eccezionale (letture > 30.000). Sequenzeremo la regione V4 dell'RNA 16s (E. coli 515-806), che è attualmente il metodo ottimizzato per Illumina HiSeq 1500. Sequenzieremo anche simultaneamente la regione V3 dell'RNA 16s per fornire un'analisi a doppio controllo dei campioni. La PCR di conferma sarà impiegata quando appropriato. I dati saranno riportati come conte totali per ciascuna specie batterica identificata.

Densità cellulare infiammatoria

Vetrini istologici di routine precedentemente colorati con ematossilina ed eosina saranno utilizzati per la determinazione della densità degli eosinofili.

Le tecniche IHC saranno utilizzate per la determinazione della densità dei mastociti. Le sezioni seriali in paraffina da 3 μm saranno asciugate all'aria e fissate a caldo sui vetrini. Le sezioni saranno deparaffinate con xilene e iodio e reidratate in una serie graduata di alcool. Utilizzando l'anticorpo monoclonale triptasi murino anti-triptasi mastocitaria umana (clone AA1, Dako, Carpinteria, CA), le sezioni saranno colorate su un Dako Autostainer 3400 automatizzato utilizzando il kit LSAB+ di Dako con streptavidina coniugata a perossidasi di rafano.

Per determinare la densità per ogni tipo cellulare, l'intero campione verrà scansionato per determinare l'area soggettiva di maggiore coinvolgimento. La densità sarà determinata contando le cellule all'interno di 5 campi ad alta potenza consecutivi (ingrandimento 400X). Saranno determinate le densità cellulari medie e massime espresse in cellule/hpf. Questo sarà completato prima della fine dello studio.

Immunoistochimica (IHC)

Verrà eseguita la colorazione IHC che può includere rispettivamente DCLK1, BDNF, TRPV1 e/o CRH-R1, a seconda dei risultati di uno studio pilota in corso. L'intensità della colorazione sarà valutata in cieco da un patologo per assegnare punteggi per l'intensità media del segnale IHC (es. 0= nessuno, 1= lieve, 2= moderato e 3= forte) così come la percentuale di cellule o fibre tissutali che mostrano un'immunoreattività positiva. Verrà applicato un sistema di punteggio semiquantitativo in cui il punteggio immunoreattivo finale sarà uguale al prodotto della percentuale di cellule positive per l'intensità media della colorazione. La percentuale di cellule o fibre positive sarà classificata come segue: 0= negativo-10%, 1= 11-33%, 2= 33-66% e 3= > 67%. L'immunoreattività sarà considerata positiva quando il punteggio combinato è compreso tra 2-6 e negativo con un punteggio di 0-1. Altre colorazioni IHC possono essere eseguite se diventano rilevanti come indicato dalla letteratura. Questo sarà eseguito prima della fine dello studio.

I punteggi T per il BASC saranno raccolti come parte di questo studio sul modulo di raccolta dati.

Queste informazioni vengono utilizzate per valutare le informazioni psicosociali del paziente. Queste saranno raccolte e registrate prima della fine dello studio.