Estudo do Microbioma da Dispepsia Funcional

Análise de Microbioma

Amostras fecais e 8 biópsias da mucosa (duodeno descendente) serão obtidas de cada indivíduo. As amostras serão processadas e o DNA isolado de acordo com as técnicas de laboratório padrão.16S A análise da sequência de rDNA de comunidades microbianas em amostras de pacientes será analisada utilizando nossas tecnologias de execução rápida HiSeq 1500. Executaremos sequenciamento final emparelhado de 2 X 150 bp, o que fornecerá cobertura excepcional (leituras > 30.000). Sequenciaremos a região V4 do RNA 16s (E. coli 515-806), que é o método otimizado para Illumina HiSeq 1500 atualmente. Também sequenciaremos simultaneamente a região V3 do RNA 16s para fornecer uma análise de controle duplo das amostras. PCR confirmatório será empregado quando apropriado. Os dados serão relatados como contagens totais para cada espécie bacteriana identificada.

Densidade de Células Inflamatórias

Lâminas de histologia de rotina previamente coradas com hematoxilina e eosina serão utilizadas para determinação da densidade de eosinófilos.

Técnicas de IHC serão utilizadas para determinação da densidade de mastócitos. Seções seriadas de parafina de 3 μm serão secas ao ar e fixadas a quente em lâminas. Os cortes serão desparafinizados com xileno e iodo e reidratados em série graduada de álcool. Utilizando anticorpo triptase monoclonal de camundongo antimastócitos triptase humana (clone AA1, Dako, Carpinteria, CA), as seções serão coradas em um Dako Autostainer 3400 automatizado usando o kit LSAB+ da Dako com estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano.

Para determinar a densidade de cada tipo de célula, toda a amostra será digitalizada para determinar a área subjetiva de maior envolvimento. A densidade será determinada pela contagem de células dentro de 5 campos consecutivos de alta potência (ampliação de 400X). Densidades celulares máximas e médias expressas como células/hpf serão determinadas. Isso será concluído antes do final do estudo.

Imuno-histoquímica (IHC)

A coloração IHC será realizada e pode incluir DCLK1, BDNF, TRPV1 e/ou CRH-R1, respectivamente, dependendo dos resultados de um estudo piloto em andamento. A intensidade da coloração será avaliada de forma cega por um patologista para atribuir pontuações para a intensidade média do sinal IHC (ou seja, 0= nenhum, 1= leve, 2= moderado e 3= forte), bem como a porcentagem de células de tecido ou fibras mostrando imunorreatividade positiva. Um sistema de pontuação sem-quantitativo será aplicado no qual a pontuação imunorreativa final será igual ao produto da porcentagem de células positivas vezes a intensidade média de coloração. A porcentagem de células ou fibras positivas será graduada da seguinte forma: 0= negativo-10%, 1= 11-33%, 2= 33-66% e 3= > 67%. A imunorreatividade será considerada positiva quando a pontuação combinada variar entre 2-6 e negativa com pontuação de 0-1. Outras colorações IHC podem ser realizadas caso se tornem relevantes conforme indicado pela literatura. Isso será realizado antes do final do estudo.

As pontuações T para o BASC serão coletadas como parte deste estudo no Formulário de Coleta de Dados.

Esta informação é usada para avaliar as informações psicossociais do paciente. Isso será coletado e registrado antes do final do estudo.