Klinische Bewertung des Bioneer Accupower Q-RFIA PCR-Kits

Titel Phase II: Multizentrische klinische Studie zur Bewertung der Leistung des Bioneer Accupower Q-RFIA PCR-Kits bei IRON qPCR zum INH-, RIF-, FQ- und AG-Resistenznachweis

Hintergrund und Begründung Der Nachweis der klinisch-diagnostischen Genauigkeit und der Betriebsmerkmale des Bioneer Accupower Q-RFIA PCR-Kits auf IRON qPCR ist erforderlich, um die Validität von Bioneer RFIA umfassend zu bewerten und globale und nationale politische Entscheidungen zu treffen.

Der Bioneer Accupower Q-RFIA-Assay. Das Produkt „Investigational Use Only“ (IUO) ist für den Nachweis von MTB und Mutationen im Zusammenhang mit RIF-, INH-, FQ- und AMG-Arzneimittelresistenz vorgesehen. Der Assay, der als Kit-Kartusche ausgeführt wird, besteht physisch aus zwei Teilen; ein Körperteil zur Nukleinextraktion und die PCR-Platte. Die Kartusche ist für die Verwendung mit dem IRON qPCR-System vorgesehen.

Das für diese Studie bereitgestellte IRON qPCR-System sollte nur zum Testen von IUO-Produkt- und Studienproben verwendet werden. Das von Bioneer entwickelte IRON qPCR-Instrument ist für den Einsatz in unteren Gesundheitssystemen vorgesehen. Das Instrument hat eine kleine Standfläche ((30,5 (W) x 27 (T) x 39,5 (H) cm), Gewicht (< 15 kg) und kann mit einer Akkuladung betrieben werden. Das System ist in der Lage, die Erkennung von 40 Zielen vollständig zu automatisieren und innerhalb von 30 Minuten von der Probe bis zum Ergebnis zu liefern.) Über das Prüfprodukt wird streng Buch geführt, einschließlich Empfang und Inventar, Lagerung, Verwendung während der Studie und Rückgabe oder Entsorgung, wie im Studienhandbuch für diese Studie beschrieben.

Andere diagnostische Tests (2. Komparatoren und Referenztests), die zur Verwendung in dieser Studie vorgesehen sind, sind:

• Xpert MTB/RIF Ultra-Assay
• Xpert MTB/XDR-Assay
• Hain MTBDRplus-Assay
• Hain MTBDRsl-Assay Gebrauchsanweisungen für das/die Prüfprodukt(e) sind in den IP-Packungsbeilagen enthalten.

Der Bioneer Accupower Q-RFIA-Assay weist Mtb und Mutationen im Zusammenhang mit INH-, RIF-, FQ- und Aminoglykosid-Resistenz direkt aus dem Sputum nach. In Übereinstimmung mit diesem Verwendungszweck werden klinische Proben direkt mit dem Bioneer Accupower Q-RFIA-Assay getestet. Der Assay wird jedoch auch zum Testen des Kulturisolats verwendet. Dieser zusätzliche Bioneer Accupower RFIA-Assay-Test ermöglicht einen Vergleich der Leistung und der Raten nicht determinierender Faktoren zwischen Tests direkt aus der Probe und Tests aus dem Kulturisolat. Es wird auch die Auflösung potenziell abweichender LPA- und NGS-Ergebnisse aus dem ursprünglichen Bioneer Accupower Q-RFIA-Testergebnis unterstützen, da diese Tests auch mit dem Kulturisolat durchgeführt werden (Diskrepanz kann als Folge von Infektionen mit einer Mischung verschiedener Stämme, wobei nur ein Stamm in Kultur gezüchtet wird). Da alle Assays an derselben Kultur durchgeführt werden, besteht außerdem kein Risiko, dass ein Assay an einer Probe unterschiedlicher Qualität getestet wird.

Um die diagnostische Leistung des Bioneer Accupower Q-RFIA PCR-Kits bei IRON qPCR effizient zu beurteilen, werden die Teilnehmer gebeten, ≥3 ml Sputum bereitzustellen (entweder ein einzelnes Sputum oder zwei nacheinander gesammelte und gepoolte Sputa). Spot-Sputa sollte gepoolt und homogenisiert werden. Bei Proben, bei denen nur eine Probe vom Teilnehmer entnommen wurde, muss die Probe homogenisiert werden. Kurz gesagt, nach einem mechanischen Homogenisierungsschritt wird die Sputumprobe geteilt und die folgenden Tests werden durchgeführt:

• Fluoreszenz-Ausstrichmikroskopie (FM-Ausstrich)
• Xpert MTB/RIF Ultra
• Xpert MTB/XDR-Assay
• Bioneer Accupower Q-RFIA

• Verflüssigung/Dekontamination durch NALC-NaOH, gefolgt von Resuspension auf PBS und Inokulation auf MGIT und Löwenstein-Jensen-Kulturmedien

  • MTB-Komplex-Bestätigung positiver Kulturen entweder durch MPT64/MPB64-Antigennachweis oder PCR (GenoType) aus jeder positiven Kultur.
  • Der phänotypische DST zum Testen von INH, RIF, Fluorchinolon (Moxifloxacin und Levofloxacin), AMK und KAN-Resistenz wird an der ersten Kultur durchgeführt, die positiv für den MTB-Komplex pro Patient ist.
  • Molekulare Tests aller MTB-Komplex-bestätigten Kulturen mit GenoType MTBDRplus und MTBDRsl
  • Eine Gesamtgenomsequenzierung wird nur von Proben durchgeführt, bei denen das Bioneer-Ergebnis (entweder aus dem Sputum- oder Kulturtest) nicht mit der phänotypischen DST übereinstimmt
  • Bioneer Accupower Q-RFIA von allen MTBC-bestätigten Kulturen

Alle diagnostischen Testergebnisse (Abstrich, Bioneer Accupower Q-RFIA auf direkter Probe, Xpert MTB/RIF Ultra auf direkter Probe, Xpert MTB/XDR auf direkter Probe, MGIT, LJ, Bioneer Accupower RFIA auf Kulturisolat, MTBDRplus, MTBDRsl und phänotypisch DST-Ergebnisse) werden von den Labortechnikern für jeden Standort auf dem Labor-CRF aufgezeichnet.

Retrospektive Proben, die aus verschiedenen Biobanken ausgewählt wurden, werden wie in Abbildung 2 angegeben verarbeitet. Falls an den retrospektiven Proben bereits Routinetests durchgeführt wurden, müssen der FM-Abstrich und Xpert MTB/RIF oder Ultra nicht wiederholt werden. Vor Beginn der Studie wertet der FIND-Studienmanager die diagnostischen Daten aus, die mit jeder Probe verknüpft sind, um zu bestimmen, welche Tests für jeden Standort durchgeführt oder wiederholt werden müssen. Der Xpert MTB/XDR-Test wird für jede ausgewählte Probe durchgeführt.

Referenzstandardtest und Indextestverfahren Kultur (LJ und MGIT), phänotypische DST und Abstrichmikroskopie werden an den Testzentren auf der Grundlage lokaler SOPs durchgeführt. Die Sequenzierung des gesamten Genoms wird an einem zentralen Ort nach einem von FIND bereitzustellenden standardisierten Protokoll durchgeführt.

Jedes teilnehmende Labor wird einer Laborbewertung aus der Ferne unterzogen, um das Qualitätsmanagementsystem des Labors zu bewerten und insbesondere eine standardisierte und qualitativ hochwertige Durchführung von Routinetests, einschließlich Abstrich, Kultur und DST, sicherzustellen. Die Ergebnisse der Referenzstandardtests werden von Technikern aufgezeichnet, die gegenüber den Indextestergebnissen blind sind, wodurch das Risiko einer Verzerrung durch die Überprüfung eliminiert wird. Das Vorhandensein des MTB-Komplexes wird für alle Patienten aus einer positiven Kultur mit einem MPT64-basierten Schnelltest oder einem von der WHO zugelassenen NAAT auf dem Kulturisolat bestätigt.

Ein Kulturreferenzstandard kann bei paucibacillärer (abstrichnegativer) TB unvollkommen sein. Dies kann zu Verzerrungen bei den Genauigkeitsschätzungen des Indextests führen: (i) Die Sensitivität kann überschätzt werden, wenn Indextest und Referenzstandard bei einem Patienten mit TB negative Ergebnisse liefern; und (ii) die Spezifität kann unterschätzt werden, wenn der Indextest bei einem Patienten mit TB, der mit dem Referenzstandard negativ getestet wurde, ein positives Ergebnis liefert. Eine voreingenommene Sensitivitätsschätzung ist akzeptabel, da sie immer noch einen aussagekräftigen Parameter darstellt (der Anteil an kulturpositiver TB, der auch durch den Indextest nachgewiesen wird). Da jedoch für TB-Assays normalerweise eine nahezu perfekte Spezifität erforderlich ist, kann eine Verzerrung der Spezifität problematisch sein. Um das Risiko falsch positiver Ergebnisse des Indextests zu mindern, werden in allen Fällen insgesamt zwei Kulturen (eine MGIT- und eine LJ-Kultur) durchgeführt.

Ein zusammengesetzter Referenzstandard aus phänotypischem DST und NGS wird für den Resistenznachweis verwendet, um ein hohes Vertrauen in den Referenzstandard für diese Studie zu gewährleisten. Die Verwendung des phänotypischen DST als Referenzstandard kann für Mutationen mit minimalen Hemmkonzentrationen um den Bruchpunkt des jeweiligen Arzneimittels unvollkommen sein. Dies kann zu Verzerrungen bei den Genauigkeitsschätzungen des Indextests führen, wenn (i) die Sensitivität überschätzt werden kann, wenn sowohl der Indextest als auch der Referenzstandard negative Ergebnisse für die Resistenz liefern; und (ii) die Spezifität kann unterschätzt werden, wenn der Indextest ein positives Resistenzergebnis liefert, während der phänotypische DST ein negatives Ergebnis liefert. Um dieses Risiko zu mindern, wird für alle Proben mit einem abweichenden Ergebnis zwischen dem Index-Assay und dem phänotypischen DST eine Sequenzierung durchgeführt. Als Teil dieser Studie werden Sequenzierungsergebnisse nur für Ergebnisse verfügbar sein, die zwischen dem Indexassay und pDST nicht übereinstimmen. Die Verwendung der Sequenzierung nur für diskrepante Proben kann auch zu einer Verzerrung der Genauigkeitsschätzungen für den Index-Assay in Fällen führen, in denen sowohl die Index- als auch die phänotypischen DST-Ergebnisse negativ auf Resistenz sind und in denen die Sequenzierung das Vorhandensein einer Mutation gezeigt hätte. Dieses Risiko ist jedoch minimal, da klinisch resistente Mutationen mit einem anfälligen Phänotyp selten sind und ihre genotypische Grundlage nicht gut verstanden wird. In solchen Fällen gilt das phänotypische DST-Ergebnis immer noch als Goldstandard. Daher betrachteten wir die Verwendung des zusammengesetzten Referenzstandards als den Ansatz mit dem insgesamt geringsten Verzerrungspotenzial und werden diesen für die Primäranalyse verwenden.

Der phänotypische MGIT DST wird mit dem Kulturisolat für jede klinische Probe durchgeführt. MGIT DST wird vor Ort durchgeführt, um die Empfindlichkeit der Kulturen gegenüber INH, RIF, Moxifloxacin, Levofloxacin, AMK und KAN bei den revidierten kritischen Konzentrationen der WHO zu bestimmen15. Eine Gesamtgenomsequenzierung wird für Proben durchgeführt, bei denen das Bioneer-Assay-Ergebnis (entweder aus dem Sputum- oder Kulturtest) nicht mit dem phänotypischen DST übereinstimmt. Die Sequenzierung des gesamten Genoms wird an DNA durchgeführt, die aus der kultivierten Probe extrahiert wurde. Die Ausgabe der phänotypischen DST- und NGS-Ergebnisse erfolgt automatisiert und erfordert keine manuelle Interpretation durch den Bediener. Testergebnisse werden nach Erhalt in das Labor-CRF eingegeben.

Der Indextest wird sowohl an der direkten klinischen Probe als auch an der positiven Kultur durchgeführt, um eine hohe diagnostische Leistung des Bioneer Accupower RFIA direkt aus dem Sputum zu gewährleisten und um eine Vergleichsbasis zu schaffen, wenn Diskrepanzen zwischen dem ursprünglichen Bioneer Accupower RFIA-Ergebnis und festgestellt werden die phänotypische DST und zusätzliche molekulare Testergebnisse (NGS und LPA). Die Ausgabe für das Bioneer Accupower Q-RFIA PCR-Kit auf IRON qPCR ist automatisiert und erfordert keine manuelle Interpretation. Wie beim Referenztest werden alle Bioneer Accupower RFIA-Testergebnisse auf dem Labor-CRF vermerkt.

GCP-Erklärung Diese Studie wird in Übereinstimmung mit dem Protokoll, der Deklaration von Helsinki, ICH-GCP, ISO 13485: 2016 (falls zutreffend) sowie allen nationalen gesetzlichen und behördlichen Anforderungen durchgeführt.