Avaliação clínica do kit Bioneer Accupower Q-RFIA PCR

Título Fase II: Estudo clínico multicêntrico para avaliar o desempenho do kit Bioneer Accupower Q-RFIA PCR em IRON qPCR para detecção de resistência a INH-, RIF-, FQ- e AG

Antecedentes e justificativa Evidências da precisão do diagnóstico clínico e características operacionais do kit Bioneer Accupower Q-RFIA PCR em IRON qPCR são necessárias para avaliar de forma abrangente a validade do Bioneer RFIA e informar a tomada de decisões políticas globais e nacionais.

O ensaio Bioneer Accupower Q-RFIA. O produto para uso apenas em investigação (IUO) destina-se à detecção de MTB e mutações associadas à resistência aos medicamentos RIF, INH, FQ e AMG. O ensaio executado como um cartucho de kit consiste fisicamente em duas partes; uma parte do corpo de extração nucleica e a placa de PCR. O cartucho deve ser usado com o sistema IRON qPCR.

O sistema IRON qPCR fornecido para este estudo deve ser usado apenas para testar produtos IUO e amostras de estudo. O instrumento IRON qPCR desenvolvido pela Bioneer destina-se a ser usado em sistemas de saúde inferiores. O instrumento ocupa um espaço pequeno ((30,5(W) x 27(P) x 39,5(A) cm), peso (< 15 kg) e pode ser operado com carga de bateria. O sistema tem a capacidade de automatizar totalmente a detecção de 40 alvos e fornecer amostra ao resultado em 30 minutos.) O produto experimental será rigorosamente contabilizado, incluindo recebimento e inventário, armazenamento, uso durante o teste e devolução ou descarte, conforme detalhado no Manual de Estudo deste estudo.

Outros testes de diagnóstico (segundos comparadores e testes de referência) fornecidos para uso neste estudo são:

• Ensaio Xpert MTB/RIF Ultra
• Ensaio Xpert MTB/XDR
• Ensaio Hain MTBDRplus
• Ensaio Hain MTBDRsl As instruções para uso do(s) produto(s) sob investigação são fornecidas nas bulas do IP.

O ensaio Bioneer Accupower Q-RFIA detecta Mtb e mutações associadas a INH, RIF, FQ e resistência a aminoglicosídeos diretamente do escarro. De acordo com este uso pretendido, as amostras clínicas serão testadas diretamente pelo ensaio Bioneer Accupower Q-RFIA. No entanto, o ensaio também será usado para testar o isolado de cultura. Este teste adicional do ensaio Bioneer Accupower RFIA permitirá uma comparação de desempenho e taxas não determinantes entre o teste direto da amostra e o teste do isolado de cultura. Ele também ajudará na resolução de possíveis resultados LPA e NGS discordantes do resultado inicial do teste Bioneer Accupower Q-RFIA, pois esses testes também serão realizados a partir do isolado de cultura (discordância pode surgir como resultado de infecções com uma mistura de cepas diferentes, com apenas uma cepa sendo cultivada em cultura). Além disso, como todos os ensaios serão realizados na mesma cultura, também não há risco de qualquer ensaio ser testado em uma amostra de qualidade diferente.

A fim de avaliar com eficiência o desempenho do diagnóstico do kit Bioneer Accupower Q-RFIA PCR em IRON qPCR, os participantes serão solicitados a fornecer ≥3ml de escarro (um único escarro ou dois escarros coletados e agrupados consecutivamente). A saliva localizada deve ser reunida e homogeneizada. Para amostras em que apenas uma amostra foi coletada do participante, a amostra precisa ser homogeneizada. Resumidamente, após uma etapa de homogeneização mecânica, a amostra de escarro será dividida e os seguintes testes serão realizados:

• Microscopia de esfregaço de fluorescência (esfregaço de FM)
• Xpert MTB/RIF Ultra
• Ensaio Xpert MTB/XDR
• Bioneer Accupower Q-RFIA

• Liquefação/descontaminação por NALC-NaOH seguida de ressuspensão em PBS e inoculação em meio de cultura MGIT e Löwenstein-Jensen

  • Confirmação do complexo MTB de culturas positivas por detecção de antígeno MPT64/MPB64 ou PCR (GenoType) de cada cultura positiva.
  • DST fenotípica para testar resistência a INH, RIF, fluoroquinolona (moxifloxacina e levofloxacina), AMK e KAN será feita na primeira cultura positiva para o complexo MTB por paciente.
  • Teste molecular de todas as culturas confirmadas do complexo MTB usando GenoType MTBDRplus e MTBDRsl
  • O sequenciamento completo do genoma só será feito a partir de amostras onde o resultado do Bioneer (do teste de escarro ou cultura) for discordante com DST fenotípico
  • Bioneer Accupower Q-RFIA de todas as culturas confirmadas MTBC

Todos os resultados dos testes de diagnóstico (esfregaço, Bioneer Accupower Q-RFIA em amostra direta, Xpert MTB/RIF Ultra em amostra direta, Xpert MTB/XDR em amostra direta, MGIT, LJ, Bioneer Accupower RFIA em isolado de cultura, MTBDRplus, MTBDRsl e fenotípico Resultados do DST) serão registrados pelos técnicos de laboratório de cada local no CRF do laboratório.

As amostras retrospectivas selecionadas de diferentes biobancos serão processadas conforme especificado na Figura 2. Caso já tenham sido realizados testes de rotina nas amostras retrospectivas, o esfregaço FM e o Xpert MTB/RIF ou Ultra não precisam ser repetidos. Antes do início do estudo, o gerente do estudo FIND avaliará os dados de diagnóstico vinculados a cada amostra para determinar qual teste precisa ser feito ou repetido para cada local. O teste Xpert MTB/XDR será realizado para cada amostra selecionada.

Teste padrão de referência e procedimentos de teste de índice Cultura (LJ e MGIT), DST fenotípica e microscopia de esfregaço serão realizados nos locais de teste com base nos SOPs locais. O sequenciamento completo do genoma será feito em um local central seguindo um protocolo padronizado a ser fornecido pelo FIND.

Cada laboratório participante passará por uma avaliação laboratorial remota para avaliar o sistema de gerenciamento de qualidade do laboratório e, mais especificamente, para garantir o desempenho padronizado e de alta qualidade dos testes de rotina, incluindo esfregaço, cultura e DST. Os resultados dos testes de padrão de referência serão registrados por técnicos cegos para os resultados do teste de índice, eliminando o risco de viés de revisão. A presença do complexo MTB será confirmada para todos os pacientes de uma cultura positiva usando um teste rápido baseado em MPT64 ou NAAT aprovado pela OMS no isolado de cultura.

Um padrão de referência de cultura pode ser imperfeito na TB paucibacilar (esfregaço negativo). Isso pode levar a um viés nas estimativas de precisão do teste índice: (i) a sensibilidade pode ser superestimada quando o teste índice e o padrão de referência produzem resultados negativos em um paciente com TB; e (ii) a especificidade pode ser subestimada quando o teste índice dá um resultado positivo em um paciente com TB cujo teste é negativo com o padrão de referência. Uma estimativa de sensibilidade tendenciosa é aceitável, pois ainda representa um parâmetro significativo (a proporção de TB com cultura positiva que também é detectada pelo teste índice). No entanto, uma vez que a especificidade quase perfeita geralmente é necessária para os ensaios de TB, o viés na especificidade pode ser problemático. Para mitigar o risco de resultados "falsos-positivos" de testes de índice espúrios, um total de duas culturas (uma cultura MGIT e uma cultura LJ) serão feitas em todos os casos.

Um padrão de referência composto de DST fenotípico e NGS será usado para detecção de resistência para garantir alta confiança no padrão de referência para este estudo. Usar o DST fenotípico como padrão de referência pode ser imperfeito para mutações com concentrações inibitórias mínimas em torno do ponto de quebra do respectivo medicamento. Isso pode levar a um viés nas estimativas de precisão do teste índice, onde (i) a sensibilidade pode ser superestimada quando o teste índice e o padrão de referência produzem resultados negativos para resistência; e (ii) a especificidade pode ser subestimada quando o teste índice dá um resultado positivo para resistência onde o DST fenotípico dá um resultado negativo. Para mitigar esse risco, o sequenciamento será feito para todas as amostras com um resultado discrepante entre o ensaio índice e o DST fenotípico. Como parte deste estudo, os resultados de sequenciamento estarão disponíveis apenas para resultados discordantes entre o ensaio índice e o pDST. O uso de sequenciamento apenas para amostras discrepantes também pode levar a um viés nas estimativas de precisão para o ensaio de índice para casos em que o índice e os resultados fenotípicos de DST são negativos para resistência e onde o sequenciamento teria mostrado a presença de uma mutação. Este risco é, no entanto, mínimo, uma vez que as mutações clinicamente resistentes com resultado de fenótipo suscetível são raras e sua base genotípica não é bem compreendida. Nesses casos, o resultado fenotípico do DST ainda é considerado o padrão-ouro. Portanto, consideramos o uso do padrão de referência composto a abordagem com o menor risco de viés geral e o usaremos para a análise primária.

O MGIT DST fenotípico será feito no isolado de cultura para cada amostra clínica. O MGIT DST será feito no local para determinar a suscetibilidade da cultura a INH, RIF, moxifloxacina, levofloxacina, AMK e KAN nas concentrações críticas revisadas da OMS15. O sequenciamento completo do genoma será feito para amostras em que o resultado do ensaio Bioneer (do teste de escarro ou cultura) for discordante com DST fenotípico. O sequenciamento completo do genoma será feito no DNA extraído da amostra cultivada. A saída para os resultados fenotípicos de DST e NGS é automatizada e não requer interpretação manual do operador. Os resultados dos testes, quando obtidos, serão inseridos no CRF do laboratório.

O teste de índice será realizado tanto na amostra clínica direta quanto na cultura positiva, para garantir o alto desempenho do diagnóstico Bioneer Accupower RFIA direto do escarro e fornecer uma base para comparação se quaisquer discordâncias forem observadas entre o resultado inicial do Bioneer Accupower RFIA e o DST fenotípico e resultados de testes moleculares adicionais (NGS e LPA). A saída para o kit Bioneer Accupower Q-RFIA PCR no IRON qPCR é automatizada e não requer interpretação manual. Assim como no teste de referência, todos os resultados do teste Bioneer Accupower RFIA serão anotados no CRF do laboratório.

Declaração GCP Este estudo será realizado em conformidade com o protocolo, a Declaração de Helsinque, ICH-GCP, ISO 13485: 2016 (se aplicável), bem como todos os requisitos legais e regulamentares nacionais.