Bioneer Accupower Q-RFIA PCR Kit Evaluación clínica

Título Fase II: Estudio clínico multicéntrico para evaluar el rendimiento del kit Bioneer Accupower Q-RFIA PCR en IRON qPCR para la detección de resistencia a INH, RIF, FQ y AG

Antecedentes y justificación Se necesita evidencia de la precisión del diagnóstico clínico y las características operativas del kit de PCR Bioneer Accupower Q-RFIA en IRON qPCR para evaluar exhaustivamente la validez de Bioneer RFIA e informar la toma de decisiones de política global y nacional.

El ensayo Bioneer Accupower Q-RFIA. El producto para uso exclusivo en investigación (IUO) está destinado a la detección de MTB y mutaciones asociadas con la resistencia a los medicamentos RIF, INH, FQ y AMG. El ensayo que se ejecuta como un cartucho de kit consta físicamente de dos partes; una parte del cuerpo de extracción de ácidos nucleicos y la placa de PCR. El cartucho está diseñado para usarse con el sistema IRON qPCR.

El sistema IRON qPCR provisto para este estudio solo debe usarse para analizar muestras del estudio y del producto IUO. El instrumento IRON qPCR desarrollado por Bioneer está diseñado para usarse en sistemas de atención médica inferiores. El instrumento ocupa poco espacio ((30,5(W) x 27 (D) x 39,5 (H) cm), peso (< 15 kg) y puede funcionar con una carga de batería. El sistema tiene la capacidad de automatizar por completo la detección de 40 objetivos y proporcionar muestra-resultado en 30 minutos). El producto en investigación se contabilizará estrictamente, incluida la recepción y el inventario, el almacenamiento, el uso durante el ensayo y la devolución o eliminación, como se detalla en el Manual de estudio para este estudio.

Otras pruebas de diagnóstico (segundos comparadores y pruebas de referencia) proporcionadas para su uso en este ensayo son:

• Ensayo Xpert MTB/RIF Ultra
• Ensayo Xpert MTB/XDR
• Ensayo Hain MTBDRplus
• Ensayo Hain MTBDRsl Las instrucciones para el uso de los productos en investigación se proporcionan en los prospectos del paquete IP.

El ensayo Bioneer Accupower Q-RFIA detecta Mtb y mutaciones asociadas con INH, RIF, FQ y resistencia a aminoglucósidos directamente del esputo. De acuerdo con este uso previsto, las muestras clínicas se analizarán directamente con el ensayo Bioneer Accupower Q-RFIA. Sin embargo, el ensayo también se utilizará para probar el cultivo aislado. Esta prueba adicional del ensayo Bioneer Accupower RFIA permitirá una comparación del rendimiento y las tasas no determinantes entre las pruebas directamente de la muestra y las pruebas del cultivo aislado. También respaldará la resolución de posibles resultados discordantes de LPA y NGS del resultado inicial de la prueba Bioneer Accupower Q-RFIA, ya que estas pruebas también se realizarán a partir del aislado de cultivo (la discordancia puede surgir como resultado de infecciones con una mezcla de diferentes cepas, con una sola cepa creciendo en cultivo). Además, como todos los ensayos se realizarán en el mismo cultivo, tampoco hay riesgo de que ningún ensayo se analice en una muestra de diferente calidad.

Para evaluar de manera eficiente el rendimiento diagnóstico del kit Bioneer Accupower Q-RFIA PCR en IRON qPCR, se les pedirá a los participantes que proporcionen ≥3 ml de esputo (ya sea un solo esputo o dos esputos recolectados y agrupados consecutivamente). Los esputos puntuales deben agruparse y homogeneizarse. Para las muestras en las que solo se recolectó un espécimen del participante, la muestra debe homogeneizarse. Brevemente, después de un paso de homogeneización mecánica, se dividirá la muestra de esputo y se realizarán las siguientes pruebas:

• Microscopía de frotis de fluorescencia (frotis FM)
• Xpert MTB/RIF Ultra
• Ensayo Xpert MTB/XDR
• Bioneer Accupower Q-RFIA

• Licuefacción/descontaminación con NALC-NaOH seguida de resuspensión en PBS e inoculación en medios de cultivo MGIT y Löwenstein-Jensen

  • Confirmación del complejo MTB de cultivos positivos mediante detección de antígenos MPT64/MPB64 o PCR (GenoType) de cada cultivo positivo.
  • La DST fenotípica para probar la resistencia a INH, RIF, fluoroquinolonas (moxifloxacina y levofloxacina), AMK y KAN se realizará en el primer cultivo positivo para el complejo MTB por paciente.
  • Pruebas moleculares de todos los cultivos confirmados del complejo MTB utilizando GenoType MTBDRplus y MTBDRsl
  • La secuenciación del genoma completo solo se realizará a partir de muestras en las que el resultado de Bioneer (ya sea de la prueba de esputo o de cultivo) sea discordante con la DST fenotípica.
  • Bioneer Accupower Q-RFIA de todos los cultivos MTBC confirmados

Todos los resultados de las pruebas de diagnóstico (frotis, Bioneer Accupower Q-RFIA en muestra directa, Xpert MTB/RIF Ultra en muestra directa, Xpert MTB/XDR en muestra directa, MGIT, LJ, Bioneer Accupower RFIA en cultivo aislado, MTBDRplus, MTBDRsl y fenotípicos los resultados del DST) serán registrados por los técnicos de laboratorio para cada sitio en el CRF del laboratorio.

Las muestras retrospectivas seleccionadas de diferentes biobancos se procesarán como se especifica en la Figura 2. En caso de que ya se hayan realizado pruebas de rutina en las muestras retrospectivas, no es necesario repetir el frotis FM y Xpert MTB/RIF o Ultra. Antes del inicio del estudio, el administrador del estudio FIND evaluará los datos de diagnóstico vinculados a cada muestra para determinar qué pruebas deben realizarse o repetirse para cada sitio. Se realizará la prueba Xpert MTB/XDR para cada muestra seleccionada.

Prueba estándar de referencia y procedimientos de prueba de índice El cultivo (LJ y MGIT), el DST fenotípico y la microscopía de frotis se realizarán en los sitios de prueba según los SOP locales. La secuenciación del genoma completo se realizará en una ubicación central siguiendo un protocolo estandarizado que proporcionará FIND.

Cada laboratorio participante se someterá a una evaluación de laboratorio remota para evaluar el sistema de gestión de calidad del laboratorio y, más específicamente, para garantizar el desempeño estandarizado y de alta calidad de las pruebas de rutina, incluidos frotis, cultivo y DST. Los resultados de las pruebas estándar de referencia serán registrados por técnicos cegados a los resultados de las pruebas índice, eliminando el riesgo de sesgo de revisión. La presencia del complejo MTB se confirmará para todos los pacientes de un cultivo positivo mediante una prueba rápida basada en MPT64 o NAAT aprobada por la OMS en el cultivo aislado.

Un patrón de referencia de cultivo puede ser imperfecto en la TB paucibacilar (frotis negativo). Esto puede conducir a un sesgo en las estimaciones de precisión de la prueba índice: (i) la sensibilidad puede sobreestimarse cuando la prueba índice y el estándar de referencia arrojan resultados negativos en un paciente con TB; y (ii) la especificidad puede estar subestimada cuando la prueba índice da un resultado positivo en un paciente con TB que da negativo con el estándar de referencia. Una estimación de sensibilidad sesgada es aceptable ya que todavía representa un parámetro significativo (la proporción de TB con cultivo positivo que también se detecta con la prueba índice). Sin embargo, dado que generalmente se requiere una especificidad casi perfecta de los ensayos de TB, el sesgo en la especificidad puede ser problemático. Para mitigar el riesgo de resultados falsos positivos de la prueba de índice, se realizarán un total de dos cultivos (un cultivo MGIT y un cultivo LJ) en todos los casos.

Se utilizará un estándar de referencia compuesto de DST fenotípica y NGS para la detección de resistencia a fin de garantizar una alta confianza en el estándar de referencia para este estudio. El uso de DST fenotípica como estándar de referencia puede ser imperfecto para mutaciones con concentraciones inhibitorias mínimas alrededor del punto de ruptura del fármaco respectivo. Esto puede conducir a un sesgo en las estimaciones de precisión de la prueba índice donde (i) la sensibilidad puede sobreestimarse cuando la prueba índice y el estándar de referencia arrojan resultados negativos para la resistencia; y (ii) la especificidad puede subestimarse cuando la prueba índice da un resultado positivo para resistencia donde la DST fenotípica da un resultado negativo. Para mitigar este riesgo, se realizará la secuenciación de todas las muestras con un resultado discrepante entre el ensayo índice y el DST fenotípico. Como parte de este estudio, los resultados de la secuenciación solo estarán disponibles para los resultados que sean discordantes entre el ensayo índice y el pDST. El uso de la secuenciación solo para muestras discrepantes también puede conducir a un sesgo en las estimaciones de precisión para el ensayo índice en los casos en que los resultados de la DST índice y fenotípica son negativos para la resistencia y donde la secuenciación habría mostrado la presencia de una mutación. Sin embargo, este riesgo es mínimo ya que las mutaciones clínicamente resistentes con un resultado de fenotipo susceptible son raras y su base genotípica no se comprende bien. En tales casos, el resultado fenotípico de DST todavía se considera como el estándar de oro. Por lo tanto, consideramos que el uso del estándar de referencia compuesto es el enfoque con el menor riesgo de sesgo en general y lo usaremos para el análisis primario.

La DST de MGIT fenotípica se realizará en el aislado de cultivo para cada muestra clínica. MGIT DST se realizará en el sitio para determinar la susceptibilidad al fármaco del cultivo a INH, RIF, moxifloxacina, levofloxacina, AMK y KAN en las concentraciones críticas revisadas de la OMS15. Se realizará la secuenciación del genoma completo para las muestras en las que el resultado del ensayo Bioneer (ya sea de la prueba de esputo o de cultivo) sea discordante con la DST fenotípica. La secuenciación del genoma completo se realizará en el ADN extraído de la muestra cultivada. La salida para los resultados fenotípicos de DST y NGS está automatizada y no requiere interpretación manual del operador. Los resultados de las pruebas, cuando se obtengan, se ingresarán en el CRF del laboratorio.

La prueba índice se realizará tanto en la muestra clínica directa como en el cultivo positivo, para garantizar un alto rendimiento diagnóstico de Bioneer Accupower RFIA directamente del esputo y para proporcionar una base de comparación si se observa alguna discordancia entre el resultado inicial de Bioneer Accupower RFIA y el DST fenotípico y resultados de pruebas moleculares adicionales (NGS y LPA). La salida del kit Bioneer Accupower Q-RFIA PCR en IRON qPCR está automatizada y no requiere interpretación manual. Al igual que con la prueba de referencia, todos los resultados de la prueba Bioneer Accupower RFIA se anotarán en el CRF del laboratorio.

Declaración de GCP Este estudio se llevará a cabo de conformidad con el protocolo, la Declaración de Helsinki, ICH-GCP, ISO 13485: 2016 (si corresponde), así como con todos los requisitos legales y reglamentarios nacionales.