Wirkung von PCR-CRISPR/Cas12a auf die frühen Antiinfektiva bei Patienten mit Open-Air-Pneumonie

Patienten auf Intensivstationen haben eine hohe Inzidenz bakterieller Infektionen in den unteren Atemwegen, hauptsächlich mit schwerer Lungenentzündung, die oft schwere Sepsis und septischen Schock verursacht, was eine der Haupttodesursachen bei Patienten ist. Derzeit ist die größte Schwierigkeit für Kliniker die kontinuierliche Zunahme der bakteriellen Resistenzrate und die Zunahme der Patientensterblichkeit aufgrund der frühen Unzulänglichkeit empirischer antiinfektiöser Behandlung. Studien haben gezeigt, dass Patienten mit VAP (Ventilator Associated Pneumonia) im frühen Stadium einen irrationalen Drogenkonsum mit einer Sterblichkeitsrate von mehr als 50 % aufweisen. Wenn die Rate des angemessenen Drogenkonsums auf 33 % gesunken ist, während die Dauer der mechanischen Beatmung und die Dauer des Krankenhausaufenthalts auf der Intensivstation erheblich verkürzt wurden. Daher sind die frühestmögliche Identifizierung von Krankheitserregern und die Verkürzung der Zeit der empirischen antiinfektiösen Behandlung sehr wichtig, um die Prognose von Patienten mit schwerer Pneumonie zu verbessern und das Auftreten bakterieller Resistenzen zu reduzieren.

Es gibt drei traditionelle Methoden zum Nachweis pathogener Mikroorganismen: 1. Die mikrobielle Kulturmethode ist das traditionellste Mittel zur Identifizierung von Pathogenen. Es ist notwendig, die Körperflüssigkeit, das Blut usw. des Patienten in einem geeigneten Medium zu inokulieren, in einem geeigneten Inkubator zu inkubieren und dann das Medikament zu verabreichen. Empfindlichkeitstests ermitteln die Resistenz von Mikroorganismen, dauern in der Regel 3-7 Tage. Bei einigen spezifischen Arten von pathogenen Mikroorganismen oder Mikroorganismen mit rauen Wachstumsbedingungen können negative Kulturergebnisse vorliegen. Daher haben die traditionellen Kultivierungsmethoden Nachteile wie schlechte Aktualität, relativ hohe Anforderungen und niedrige positive Kultivierungsrate (30–40 %). 2. Flugzeit-Massenspektrometrie: Die Massenspektrometrie-Technik wird verwendet, um die Proteinkomponenten des Stamms zu analysieren und nachzuweisen, und das charakteristische Peak-Spektrum wird erhalten. Abgleich mit der Bakterienkarte in der Datenbank können die Bakterien durch Matching beurteilt werden. Das Verfahren kann im Vergleich zum herkömmlichen Kulturverfahren um etwa 6–8 Stunden verkürzt werden, aber da der Nachweis der Kolonie eine bestimmte Menge erreichen muss, kann die Probe nach Erhalt der Probe nicht direkt nachgewiesen werden, und die vorläufige mikrobielle Kultur ist erforderlich. Daher dauert die Erkennung immer noch 1–2 Tage oder länger, und es besteht auch der Nachteil einer geringen Aktualität. Darüber hinaus ist die Erweiterung und Vereinheitlichung der Datenbasis abzugleichen, und die Unfähigkeit, die Resistenz von Mikroorganismen zu analysieren, ist auch die Unzulänglichkeit der Nachweistechnologie. 3. Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie: Mit der rasanten Entwicklung der Molekularbiologie in den letzten Jahren wird die Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie weit verbreitet in der Frühdiagnose der klinischen Mikrobiologie eingesetzt, das Prinzip beruht hauptsächlich auf der Verbindung des universellen Linkers mit der Fragmentierung sequenziert werden. Genomische DNA, die Zehnmillionen von polyklonalen Polymerase-Kettenreaktions-Arrays aus Einzelmolekülen produziert, dann groß angelegte Primer-Hybridisierungs- und Enzymverlängerungsreaktionen durchführt und vollständige DNA-Sequenzinformationen durch Computeranalyse erhält. Diese Technologie ist jedoch schwierig, effektiv zwischen pathogenen Bakterien und Hintergrundbakterien zu unterscheiden, Technologie und Datenbank müssen standardisiert werden, die Erkennungszeit dauert immer noch etwa 2 Tage, kann keine mikrobielle Resistenz erhalten, teuer und andere Mängel im Büro. Zusammenfassend wird die derzeitige Frist für eine gezielte antiinfektiöse Behandlung 2 Tage nach der Probenentnahme gestoppt. Daher ist die Suche nach einer neuen, schnelleren, genaueren und empfindlicheren Erkennungstechnologie für pathogene Mikroorganismen in den letzten Jahren ein Hotspot und ein schwieriger Punkt auf dem Gebiet der Mikroben- und Antiinfektivaforschung.

Die vom College of Life Sciences der Nanjing University entwickelte PCR-CRISPR/Cas12a-Kombinationstechnologie der Alveolarspülflüssigkeit basiert auf PCR-Amplifikation und zweimaliger Fluoreszenzsignaldetektion, um die Anwesenheit und Abwesenheit spezifischer DNA-Sequenzen in der Testprobe nachzuweisen. Technologie. Die Bestimmung des Nachweisergebnisses des Krankheitserregers der klinischen Probe basiert auf dem Vergleich der Fluoreszenzergebnisse des PCR-Produkts der Probe DNAD mit den Fluoreszenznachweisergebnissen der Positivkontrolle (PC) und der Negativkontrolle (NC) als Standard . Die spezifische Erkennungsfunktion des CRISPR/Cas12a-Systems beruht auf der spezifischen Führung und Bindung der crRNA an spezifische DNA, und die Spezifität der crRNA wird durch den Nachweis einer positiven Kontrolle eines gemeinsamen Pathogens durch eine einzelne crRNA bestimmt. Die Nachweistechnologie ist hochspezifisch und dauert nur 2-3 Stunden, was einen qualitativen Sprung in der Nachweiszeit im Vergleich zur herkömmlichen Technologie darstellt.

Um die Durchführbarkeit und Genauigkeit der Technologie zu überprüfen, führten das Zentrum und die Nanjing University of Life Sciences für die häufigen Erreger der Intensivpneumonie (Acinetobacter baumannii, MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa usw.) für Alveolar eine Vorstudie durch Kombinierte PCR-CRISPR/Cas12a-Nachweistechnik für Spülflüssigkeit. Neunundzwanzig Proben der alveolären Lavageflüssigkeit der unteren Atemwege wurden mit einer herkömmlichen Bakterienkulturmethode kultiviert und mit PCR-CRISPR/Cas12a kombiniert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Genauigkeit des Nachweises und der Identifizierung von Krankheitserregern basierend auf der PCR-Cas12a-Technologie 93,10 % (27/29) erreichte. Bei den 27 Proben können die durch die herkömmliche Isolationskulturmethode infizierten Krankheitserreger durch die PCR-CRISPR/Cas12a-Technologie nachgewiesen werden. Die beiden Ausnahmen waren der Nachweis von Acinetobacter baumannii in der Probe Nr. 6 durch das herkömmliche Isolationskulturverfahren und der Nachweis von Proteus mirabilis in der Probe Nr. 13 (nicht im Bereich der nachgewiesenen Pathogene). Darüber hinaus unterschieden sich die durch die PCR-CRISPR/Cas12a-Kombinationstechnik identifizierten Krankheitserreger um mehr als ein oder zwei von den traditionellen Kulturmethoden, was mit der PCR übereinstimmte, was darauf hindeutet, dass die Empfindlichkeit viel höher ist als die der herkömmlichen mikrobiellen Kultur, und die Ergebnisse sind zuverlässig. Diese vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass die kombinierte PCR-CRISPR/Cas12a-Nachweistechnik eine gute Genauigkeit und hohe Empfindlichkeit aufweist.

Auf dieser Grundlage spekulierte das Forschungsteam, dass die Kombination von PCR und CRISPR/Cas12a-Nachweistechnologie von alveolärer Lavageflüssigkeit zur Steuerung der antiinfektiösen Behandlung von Lungenentzündungspatienten eine gezielte antiinfektiöse Behandlung erreichen und die Patientenprognose verbessern kann. Um die obige Hypothese zu validieren, haben wir eine multizentrische randomisierte prospektive Studie entworfen, in der die Auswirkungen des kombinierten PCR-CRISPR/Cas12a-Nachweises mit alveolärer Lavage-Flüssigkeit und traditionellen mikrobiellen Nachweistechniken auf die antimikrobielle Anpassung und Prognose bei Patienten mit Intensivpneumonie verglichen wurden. Ziel ist es, eine schnellere, genauere und empfindlichere Mikrobenerkennungstechnologie für Patienten mit Lungenentzündung zu finden und eine frühere Präzisionsbehandlung zu erreichen.