Influencias epigenéticas en el dolor agudo y crónico posquirúrgico

(i) Sujetos: sesenta sujetos que se someterán a una cirugía del tercer molar (en lo sucesivo, "casos") serán reclutados del Queen Mary Hospital y el Prince Philip Dental Hospital y sesenta sujetos de control emparejados por edad y sexo que no se someterán a cirugía en los próximos 3 meses, ni haber sido intervenido quirúrgicamente en el último año (en adelante denominados 'controles') también serán reclutados de la Consulta Externa del mismo hospital.

(ii) Métodos: Se explicarán los objetivos y detalles del estudio a cada sujeto y se solicitará el consentimiento informado de cada uno de ellos. Se adaptará un cuestionario diario del dolor desarrollado por nuestro grupo para evaluar el dolor experimentado por cada sujeto antes y después de la cirugía. El personal investigador acompañará a cada sujeto del caso y completará con ellos el cuestionario del diario del dolor durante la visita cuando se tome la sangre de los pacientes.

Los siguientes cuestionarios de salud serán completados por los sujetos reclutados:

SF-36: perfil de 8 escalas de puntuaciones de salud y bienestar funcionales, así como medidas de resumen de salud física y mental basadas en psicometría HADS: evaluación del estado psicológico de los sujetos (ansiedad y depresión)

Evaluación del dolor:

El dolor en reposo y durante la apertura se evaluará utilizando una escala de calificación numérica (NRS, 1 = sin dolor, 10 = dolor más intenso) en los siguientes momentos:

1. Antes de la cirugía
2. 4 horas después de la cirugía durante 16 horas
3. A los 24, 48 y 72 después de la cirugía
4. 1 mes después de la cirugía por entrevista telefónica.
5. 3 meses después de la cirugía por entrevista telefónica. Si hay dolor, se harán preguntas sobre el dolor neuropático.

Se extraerá sangre venosa con EDTA (10 ml) en cada ocasión de cada caso una hora antes de la cirugía, 1 hora y 3 horas después de la cirugía. Luego se les pedirá que regresen al hospital de 3 a 5 días después de la cirugía para una extracción de sangre más, y se separarán los macrófagos de la sangre y se extraerá el ARN total tan pronto como sea posible después de la extracción de sangre de la mitad de las células totales. El resto de las células (macrófagos) se almacenará a -80oC y se agrupará en lotes para la extracción de ADN. Se extraerá sangre venosa con EDTA (20 ml) de cada sujeto de control en un momento conveniente para ellos y nuevamente, de 3 a 5 días después de la primera extracción de sangre. La sangre extraída de los sujetos de control se tratará exactamente de la misma manera que la sangre extraída de los sujetos del caso. Por lo tanto, se obtendrán cuatro muestras en total de cada sujeto de caso y control.

El tamaño de las regiones promotoras de IL-6 y TNF-α que abarcan las secuencias aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción, así como parte del primer exón, se determinará a partir de la búsqueda bibliográfica y utilizando una base de datos como referencia, las islas CpG se identificarán primero para primer diseño (http://www.cpgislands.com/). Para el análisis de metilación se utilizará un kit comercial (EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit de Qiagen, Hilden, Alemania).

Las muestras se someterán a conversión de bisulfito y las citosinas no metiladas se desaminarán, formando uracilos. Las citosinas metiladas permanecerán sin cambios. La ubicación de la citosina metilada de la secuencia del gen y la cantidad de citosina metilada se identificarán y cuantificarán mediante pirosecuenciación utilizando técnicas establecidas. Los resultados se expresarán como % de metilación en la región promotora de IL-6 y NF-ĸB.

Nota: La técnica de pirosecuenciación solo puede analizar fragmentos de ADN de hasta 50 pares de bases en una reacción. Según los datos de CpG Island Searcher, y cuando el % de GC se estableció en 55 %, el CpG observado/CpG esperado establecido en 0,65 y las brechas entre islas adyacentes establecidas en 100 pb, no se pueden encontrar islas CpG ni en IL-6 ni en el promotor TNFα. Por lo tanto, se estudiará el estado de metilación de toda la región promotora en ambos genes utilizando 40 pares de cebadores para cada gen (con el fin de cubrir 2 kb de la región promotora). Se adopta este enfoque porque es el más sensible y fiable para la determinación de la metilación del ADN específica del sitio en una región extendida, como una región promotora.

(iii) Diseño del estudio: Este es un estudio de casos y controles. Las muestras utilizadas en este estudio serán muestras de sangre total tomadas antes y después de la cirugía de los casos, y en un momento pareado, de los controles.

Cálculos de potencia: No existen datos sobre el nivel de metilación del ADN en la región promotora de IL-6 y TNF-α en sujetos sanos normales. Los cálculos de potencia revelan que se requiere que 51 sujetos en cada grupo tengan una potencia del 80 % para detectar una diferencia real en la variable de interés con un nivel de significación del 5 % (cálculos utilizando el software G*Power, versión 3.1). Se reclutará un total de 60 sujetos en cada grupo para tener en cuenta las tasas de abandono.

(iv) Procesamiento y análisis de datos: se realizará una prueba t pareada (o equivalente no paramétrica) para investigar las diferencias en el nivel de metilación del ADN antes y después de la cirugía. Se utilizará la prueba t no pareada para investigar la diferencia en el nivel de metilación del ADN entre casos y controles. El análisis correlacional se utilizará para investigar las relaciones entre el estado de metilación y la expresión de IL-6 y TNF-α. Se emplearán estadísticas descriptivas para describir los cambios en el estado de metilación (es decir, si se metilan diferentes sitios en la isla CpG) en la región promotora de IL-6 y TNF-α B, antes y después de la cirugía y en los dos tiempos de muestreo diferentes. puntos de los sujetos de control.

Propósito y potencial: Este es un estudio piloto exploratorio de epigenética ambiental sobre el efecto de la cirugía bilateral del tercer molar en los cambios de metilación del ADN en la región promotora de IL-6 y NF-ĸB, y la influencia del estado de metilación en la expresión génica. Los resultados proporcionarán información y promoverán la comprensión de los mecanismos moleculares a través de los cuales el estado de metilación de los genes inflamatorios puede afectar la experiencia del dolor después de la cirugía.