Influências epigenéticas na dor aguda e crônica pós-cirúrgica

(i) Indivíduos: Sessenta indivíduos que serão submetidos à cirurgia de terceiros molares (doravante conhecidos como 'casos') serão recrutados no The Queen Mary Hospital e no Prince Philip Dental Hospital e sessenta controles com idade e sexo pareados que não serão submetidos à cirurgia nos próximos 3 meses, nem foram submetidos a cirurgia no último ano (doravante denominados 'controles') também serão recrutados no departamento de ambulatório do mesmo hospital.

(ii) Métodos: Os objetivos e detalhes do estudo serão explicados a cada sujeito e o consentimento informado será solicitado a cada um deles. Um questionário diário de dor desenvolvido por nosso grupo será adaptado para uso na avaliação da dor sentida por cada sujeito pré e pós-operatório. A equipe de pesquisa acompanhará cada sujeito do caso e preencherá o questionário do diário de dor com eles durante a visita quando o sangue dos pacientes for coletado.

Os seguintes questionários de saúde serão preenchidos pelos sujeitos recrutados:

SF-36: Perfil de 8 escalas de pontuação de saúde funcional e bem-estar, bem como medidas resumidas de saúde física e mental com base psicométrica HADS: Avaliação do estado psicológico dos sujeitos (ansiedade e depressão)

Avaliação da dor:

A dor em repouso e durante a abertura será avaliada usando uma escala de classificação numérica (NRS, 1 = sem dor, 10 = dor mais intensa) nos seguintes momentos:

1. antes da cirurgia
2. 4 horas após a cirurgia por 16 horas
3. Aos 24, 48 e 72 dias após a cirurgia
4. 1 mês após a cirurgia por entrevista telefônica.
5. 3 meses após a cirurgia por entrevista telefônica. Se houver dor, serão feitas perguntas sobre dor neuropática.

Sangue venoso EDTA (10ml) em cada ocasião será coletado de cada caso uma hora antes da cirurgia, 1 hora e 3 horas após a cirurgia. Em seguida, eles serão solicitados a retornar ao hospital 3 a 5 dias após a cirurgia para mais uma coleta de sangue, e os macrófagos serão separados do sangue e o RNA total será extraído o mais rápido possível após a coleta de sangue de metade das células totais. O restante das células (macrófagos) será armazenado a -80oC e agrupado para extração de DNA. Sangue venoso com EDTA (20 ml) será coletado de cada sujeito de controle em um momento conveniente para eles e novamente, 3 a 5 dias após a primeira coleta de sangue. O sangue retirado dos sujeitos de controle será tratado exatamente da mesma forma que o sangue retirado dos sujeitos do caso. Portanto, quatro amostras no total serão obtidas de cada sujeito caso e controle.

O tamanho das regiões promotoras de IL-6 e TNF-α abrangendo as sequências a montante do local de início da transcrição, bem como parte do primeiro éxon, será determinado a partir de pesquisa na literatura e, usando um banco de dados para referência, as ilhas CpG serão identificadas pela primeira vez para projeto de primer (http://www.cpgislands.com/). Para análise da metilação, será utilizado um kit comercial (EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit da Qiagen, Hilden, Alemanha).

As amostras sofrerão conversão bissulfito, e as citosinas não metiladas serão desaminadas, formando uracilos. As citosinas metiladas permanecerão inalteradas. A localização da citosina metilada da sequência do gene e a quantidade de citosina metilada serão identificadas e quantificadas por Pirosequenciamento utilizando técnicas estabelecidas. Os resultados serão expressos em % de metilação na região promotora de IL-6 e NF-ĸB.

Nota: A técnica de pirosequenciamento só pode analisar fragmentos de DNA de até 50 pares de bases em uma reação. De acordo com os dados do CpG Island Searcher, e quando o % GC foi definido em 55%, CpG observado/CpG esperado definido em 0,65 e lacunas entre ilhas adjacentes definidas em 100bp, nenhuma ilha CpG pode ser encontrada em IL-6 ou o promotor TNFα. Portanto, o estado de metilação de toda a região promotora em ambos os genes será estudado usando 40 pares de primers para cada gene (para cobrir 2kb da região promotora). Esta abordagem é adotada, pois é a mais sensível e confiável para a determinação da metilação do DNA específica do local em uma região estendida, como uma região promotora.

(iii) Desenho do estudo: Este é um estudo de caso-controle. As amostras utilizadas neste estudo serão amostras de sangue total colhidas pré e pós-cirurgia dos casos, e em tempo combinado, dos controles.

Cálculos de potência: Não existem dados sobre o nível de metilação do DNA na região promotora de IL-6 e TNF-α em indivíduos saudáveis ​​normais. Os cálculos de poder revelam que 51 sujeitos em cada grupo precisam ter um poder de 80% para detectar uma diferença real na variável de interesse a um nível de significância de 5% (cálculos usando o software G*Power, versão 3.1). Um total de 60 indivíduos será recrutado em cada grupo para levar em consideração as taxas de abandono.

(iv) Processamento e análise dos dados: Teste t pareado (ou equivalente não paramétrico) será realizado para investigar diferenças no nível de metilação do DNA pré e pós-cirurgia. O teste t não pareado será usado para investigar a diferença no nível de metilação do DNA entre casos e controles. A análise correlacional será utilizada para investigar as relações entre o estado de metilação e a expressão de IL-6 e TNF-α. Estatísticas descritivas serão empregadas para descrever as mudanças no status de metilação (ou seja, se diferentes locais na ilha CpG forem metilados) na região promotora de IL-6 e TNF-α B, pré-pós-cirurgia e nos dois tempos de amostragem diferentes pontos dos sujeitos de controle.

Objetivo e potencial: Este é um estudo piloto exploratório de epigenética ambiental sobre o efeito da cirurgia bilateral de terceiros molares nas alterações de metilação do DNA na região promotora de IL-6 e NF-ĸB e a influência do estado de metilação na expressão gênica. Os resultados fornecerão informações e promoverão a compreensão dos mecanismos moleculares através dos quais o estado de metilação de genes inflamatórios pode afetar a experiência da dor pós-cirúrgica.